PCR一直擴增的很好，但是突然就擴增不出來，有沒有大佬可以幫我解答一下？

05-01

以煙草基因組DNA為模板，擴增一個基因片段，一直擴增的很好，但是突然就擴增不出來了，只有重新設計一對這個基因上別的位置的引物就可以擴增出來，但是過幾天就又擴增不出來，有沒有大佬可以告訴我一下問題出在哪啊？

1、同時用mix做一個其他基因的pcr，檢測mix有沒有問題，記得看看你的mix延伸速度，別是混用了其他人的mix，延伸太慢了肯定擴不出來。如果你的引物可以pcr其他東西有條帶，也可以試試，看看引物有沒有問題。

2、改變PCR退火溫度，有雜帶就提高溫度，沒條帶就降低溫度，或者用降落PCR程序，依次遞減退火溫度，試試能不能行。

3、如果mix沒問題，改變溫度沒有影響，就推測引物或者模板有問題，看看是不是保存DNA的冰箱溫度不夠低，我實驗室一般常用的DNA模板和引物保存溫度是-20℃，不常用的放在-60℃或者-80℃。你可以設計新的引物，把原引物PCR不出來的模板包含進去，然後擴增出來轉T載體上然後送測序，用T載體上的引物作為測序開始的兩端，避免測序兩端不準確的情況。然後比對序列是不是引物的地方突變了。

4、如果測序序列沒問題，應該就是引物降解了，那就確實是你的引物沒有保存好。

飯時一答。雖然我作為一個學術辣雞...但是pcr失敗我有pile of experiences。

你這個問題有細節問題描述的還不夠詳細，比如是做subclone還是genotyping，如果做subclone一般是不需要反覆做同一對引物的PCR的，所以我對此有點困惑。另外也沒有說明pcr做不出來的形態是什麼樣的。Lane是一片糊還是什麼都沒有，還是引物二聚體。。。等等。失敗也是有各種樣式的???，被實驗摧殘的我如是說。

Trouble shooting有幾個方面可以尋找：試劑和儀器。

試劑方面有很多問題可循。引物，模板，酶或者mix都有可能。1.對於引物：因為是多次使用過的引物，所以不考慮引物不好而考慮多次凍融導致降解，解決問題就是重新訂購新引物再進行嘗試。2模板：濃度是否因為降解變低或者導致結合位點結合不上去，解決方法也是要重新制模板另模板濃度測定一下是否還在酶所要求的濃度範圍。3. 酶或mix：有一個薛定諤的定律就是：你永遠不知道其他實驗室成員在什麼時候把什麼試劑放在室溫多久，所以簡單粗暴，重新換一隻酶

對於儀器：如果結果不穩定有可能是pcr儀不穩定或者不幹凈。解決方法：換別的lab的pcr儀嘗試，或者將pcr儀的放置樣品位置里里外外用酒精擦一遍再晾乾重p試試。

還有一些tips。。。然而我吃完飯了。。。同為實驗狗，加油啦(? ??_??)?

PCR實驗包括反應體系的配置和反應程序，反應體系中有模板、引物、dNTP、酶、buffer、Mg2+，反應程序又包括預變性、變性、退火、延伸和徹底延伸。那麼在PCR出現問題時主要是從反應體系的各個組分和反應程序上來進行調節優化。

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實驗組無擴增條帶

(1) 引物

檢查人工合成的引物是否因存儲條件不當而降解（建議用新合成的引物進行嘗試）；引物設計是否合理，可利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物（如果之前用過該引物，可排除引物設計問題）。

(2) 模板

長期放置、反覆凍融會導致模板斷裂、開環或降解，應使用新鮮製備的DNA雙鏈作為模板；模板GC含量過高會導致DNA的雙鏈無法打開，此時加入PCR Enhancer，可以有效降低解鏈溫度；模板為粗品，有可能是DNA未釋放出來（若樣本為植物葉片，要確保植物為非多糖多酚植物，取新鮮幼嫩的葉片，並將葉片面積剪小，如黃槍頭尖部面積大小；可適當延長裂解時間）或存在抑制物（建議降低模板濃度，嘗試不同稀釋倍數的模板）；若模板為cDNA，要確認逆轉錄所用RNA的純度、完整度以及逆轉錄所用的引物（若擴增長片段，建議使用高質量的RNA逆轉錄，逆轉錄時不加隨機引物）。

(3) 酶

反應所用的酶因保存或運輸不當而失活，建議更換新酶或用另一來源的酶重新實驗。

(4) 擴增體系

反應體系配製錯誤，建議重複實驗。

(5) 反應程序

檢查變性溫度是否準確，PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，如果溫度過高，酶在前幾個循環就迅速失活，溫度過低則模板變性不徹底；若模板為酵母菌，可將預變性時間延長10min；退火溫度不合適，可對退火溫度設置梯度，摸索最佳的退火溫度；如果目的片段較長，可嘗試Touch Down 程序；檢查延伸時間是否充足。

(6) Mg2+濃度不合適

Mg2+濃度過低可影響PCR產量甚至使PCR擴增失敗；Mg2+濃度過高會降低PCR的特異性，應適當調整Mg2+濃度。