獲取後不能直接對目的基因酶切的原因是什麼？
答案說因為cDNA中只有編碼氨基酸的序列，直接酶切會導致基因結構破壞，不理解這說的什麼意思！
瀉藥。
這個題目就是錯的啊。
目的基因獲得一般可以通過cNDA文庫質粒或者所需基因的mRNA通過反轉錄獲得，這時候不能酶切的原因是載體沒有酶切位點恰好把目的基因切下來，最好的方法是在引物上設計酶切引物通過PCR加上酶切位點。
首先直接回答不能切cDNA的原因是cDNA就是真核基因翻譯後形成mRNA，再逆轉錄形成的單鏈DNA，此時的單鏈cDNA經過PCR擴增可以得到目的基因的雙鏈DNA片段。酶切不能識別單鏈cDNA，因此不能直接切cDNA；題目中還是比較細緻的，說的是不能直接酶切目的基因，都說了是目的基因，當然不能切了，切開了不就切壞了，還擴增個求。
回答完問題我們再來看這種題目，在現在的實驗室實際操作中根本就不會有人這麼去做。
第一. 如果需要在大腸桿菌中表達胰島素，根本不會去真核細胞中去PCR，而是去搜胰島素蛋白的氨基酸序列，再根據大腸桿菌表達系統進行密碼子優化，然後直接合成目的基因序列。直接擴增的真核序列由於密碼子在在原核細胞中偏好性不一樣，根本不能做到最大化高效表達，所以沒人會這麼設計且費力不討好。
第二. 上述的質粒也是奇葩，也就是為了出題故意刁難罷了，且不說不一定非要用這種抗性基因內部的酶切位點，即便是不用酶切位點，也有大把的方法可以不插在抗性基因裡面。還有為什麼非要EcoRI和BamHI，我非要就用一個HindIII直接加在兩段，也是有可能得到目的質粒，只不過鑒定麻煩一些，但並非不可能。最後，還有一個非常重要的問題，編碼閱讀框在哪裡。如果按照提設，那就是把胰島素基因插入了氨苄基因內部，如果沒有添加特別的切割位點或者連接序列，最後胰島素基因肯定是會被amp啟動子給表達出一個融合蛋白出來，既不是胰島素，也不是氨苄抗性蛋白。
結論: 實驗失敗。
答案胡說八道啊……
不對目標基因酶切的原因是，目標基因在你需要的位置大概率根本就沒有你需要的酶切位點。常用的酶切位點丰度很低。如果目標基因的兩端剛好有你需要的酶切位點，而內部又沒有被切斷的位點，為什麼不用？基本沒聽說誰遇到過就是了。
如果酶切會改變「基因結構」，那你用引物在需要的位置引入了，還是一樣不能酶切，不然「基因結構」還是會改變。難道出題人以為內切酶會繞開你的「基因結構」，只切引物引入的位點？
另外，答案說引入BamHI和EcoRI位點，且不說根本不知道胰島素編碼區是否含有這兩個位點，這是什麼年代的質粒，把這兩個常用的位點包含到最常用的篩選標記裡面去……資本家不賺錢的嗎？
如果是你們老師出的題，乖乖聽老師的話，自己心裡明白就好了。如果是參考書，扔了吧。
首先要搞清楚，cDNA，內含子，外顯子是幹啥的。
內含子：非編碼序列，可被轉錄，但在mRNA加工過程中被剪切掉，故成熟mRNA上無內含子編碼序列
外顯子：編碼序列，最後要翻譯成蛋白質的。mRNA生成以及加工過程中，都存在。
cDNA庫：簡單來說就是提取細胞內的mRNA，因為mRNA裡面沒有內含子（非編碼序列），逆轉錄成cDNA中也沒有了。
現在得到的cDNA中的序列都是有用的。所以不能酶切掉。雖然可能存在一些酶切位點。
那怎麼辦呢？怎麼和載體連接呢。
在PCR的時候要設計酶切位點，也就是在這段序列的兩端加上酶切位點的序列。再去PCR
然後酶切
當外源DNA與載體DNA都具有相同限制性內切酶識別位點，二者黏性末端互補，可以形成重組DNA分子。
由於cDNA只有編碼蛋白質的序列，直接進行酶切有兩種可能的結果
第一種，沒有識別到切割位點，切割失敗
第二種，識別到切割位點，在位點進行切割，此時，用於編譯蛋白質的基因被切開，不再是完整的基因，被切下的部分，加入到質粒中，而轉錄mRNA，進而翻譯成蛋白質時，也只能轉錄這一部分基因片段，然而事實上，要翻譯出胰島素，需要轉錄切割前的整個DNA片段
正確的做法是在被選出的目的基因兩端加上可以被當做位點識別的DNA序列，再進行酶切
基因的編碼部分分為外顯子和內含子，外顯子是編碼氨基酸，內含子不編碼氨基酸，外顯子轉錄為mRNA，以此為模板逆轉錄編碼DNA形成的DNA只包含外顯子，就是cDNA。直接沒切cDNA，破壞原有氨基酸編碼。
所謂破壞基因結構就是不要把目標基因切斷，cDNA沒有內含子可以直接原核表達，前提是目標基因完整，才能表達完整的蛋白質。
不能直接酶切難道不是因為cDNA兩端沒有酶切位點嗎？通過PCR引入酶切位點同時大量獲得目的片段它不香嘛？
I say 高中生物很多都是形式主義，背個答案聽個樂呵，真有興趣，建議普生開始當課外書看，搞不好過個十年你就會在實驗室里搬磚了【笑】
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