免疫沉澱解決方案：高產量和高純度
第一步：了解免疫沉澱是什麼？我為什麼要做免疫沉澱呢？
免疫沉澱（immunoprecipitation，IP）是利用抗原抗體特異性反應，從特定混合物（通常是細胞裂解液或表達上清）中純化富集目的蛋白的一種方法。傳統的IP實驗是抗體與目的蛋白結合後，再與蛋白Protein A /G（結合抗體Fc片段）偶聯的瓊脂糖或磁珠孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G-抗體-目的蛋白複合物，複合物經過洗滌、洗脫後用於後續下游實驗。IP是許多蛋白質相關研究的重要步驟，用於研究蛋白質的存在、相對丰度、蛋白表達的上下調、蛋白至穩定性及相互作用等。
（傳統IP原理圖）
總結：
IP的整個過程我需要用到的關鍵工具有：
一抗：選擇能與我的樣本發生反應，能做IP實驗的一抗；
Potein A，Potein G或Protein A /G：Potein A，Potein G及Protein A /G與不同來源及亞型的免疫球蛋白結合能力不一樣，如何選擇？請參考https://www.abbkine.com/affinity-of-protein-a-protein-g-and-protein-ag/
第二步：發現竟然沒有合適的一抗來滿足我需要做的免疫沉澱？
某些目的蛋白因為沒有對應的特異性抗體而無法進行免疫沉澱，如抗體所識別的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽，無法與目的蛋白相互作用或抗體選擇不合適，所選抗體不能識別處於天然構象的蛋白等，可以採用一個表位標記蛋白後，再選擇針對此表位的標籤抗體來進行免疫沉澱。廠家會推出一些常見的標籤抗體用於IP實驗，涉及flag、HA、His、Myc等標籤，以滿足大多數客戶的需求。
特別是瓊脂糖/磁珠偶聯的標籤抗體，能最大限度優化免疫沉澱實驗，節省時間和成本。
1）原理：省去了Protein A/G與抗原-抗體複合物結合的步驟，且解決了Protein A/G和抗體結合能力弱的問題。偶聯抗體直接和目標蛋白結合後，通過離心或使用磁力架，將目標蛋白從細胞裂解液中分離出來。高特異性單克隆標籤抗體可實現高產量和高純度，穩定、預封閉的填料及特異性抗體減少了免疫沉澱過程中的非特異性結合。
（瓊脂糖/磁珠偶聯的標籤抗體應用於IP）
第三步：免疫沉澱後WB (IP-WB)出現重鏈、輕鏈干擾，怎麼辦？
在免疫沉澱實驗後的WB驗證環節中，當使用常規的 Anti-IgG (H+L) 酶標二抗時，通常會出現對應免疫沉澱一抗變性後產生的重鏈（50kDa）和輕鏈（25kDa）兩條帶。如果檢測的目的蛋白分子量在此附近時，就會受到這兩條帶的干擾。如何避免干擾，
方法一：選擇只和重鏈或輕鏈反應的二抗。如果目標蛋白分子量小於30KD，為了避免抗體輕鏈的干擾，選擇重鏈特異性二抗；如果目標蛋白分子量大於30KD，為了避免抗體重鏈的干擾，選擇輕鏈特異性二抗；
「使用IPKine Mouse Anti-Rabbit IgG LCS 輕鏈特異性二抗檢測NUP50蛋白的IP結果，完美解決重鏈干擾問題！ 」 CAT #: A25022
方法二：選擇WB一抗時，選擇和IP用一抗不同的種屬，避免IP一抗的干擾；
方法三：選擇HRP直接偶聯的WB一抗，省去二抗的步驟。
免疫沉澱三步擊破，你掌握了嗎？如有疑問，歡迎來撩！
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