western-blot實驗經驗總結

04-16

我做了很久的WB，最大的一個難點感覺在於樣品製備上！蛋白的降解有些時候是你想像不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全沒事~~如果單獨做WB的話，感覺以「快速徹底裂解，先變性後保存」的原則比較有效，盡量選擇足夠強的裂解液，甚至直接給loading buffer裂解，然後取出部分蛋白定量，其餘加入loading buffer100度充分變性，再分裝保存。有些時候比蛋白酶抑製劑更有效。

另一個感覺就是樣品中目的蛋白的量，限於WB的檢測下限問題，一般目的蛋白量最好別低於1ng（雖然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上為好。這就要求在做WB之前必須充分考慮目的蛋白的可能丰度，最好充分的準備工作然後再設計細胞量或者組織量，千萬別把樣品搞稀了，否則就不好辦了。

還有一個就是顯影液的選擇。如果選擇了不合適的顯影液，就會造成背景高，靈敏度差，易淬滅，發光時間短等問題。建議選擇合適的顯影液。我用的是Enlight-plus這一款ECL發光液，超靈敏的，發光時間也挺長，最後出來的圖像很清晰。

最後，還是多看文獻，在做某個蛋白之前最好看看別人是如何做的，有什麼特殊要求，內參如何選等等。