ImageJ實用技巧——平均熒光強度檢測(定量分析篇)
免疫熒光染色是研究特異蛋白抗原在細胞內分布的一種常用實驗技術，通過熒光素所發的熒光可在熒光顯微鏡下對抗原進行細胞定位。
但免疫熒光的照片不僅僅可以做形態學分析，還能通過檢測平均熒光強度，對特異性蛋白表達進行半定量分析。
下面是一張激光共聚焦顯微鏡拍的熒光照片，通過這個實例介紹一下，怎麼利用ImageJ進行平均熒光強度的檢測。
1、加開圖像後，將圖像轉為8-bit（Image-Type-8-bit）
2、反轉圖像（Edit-Invert）
3、進行校準（Analyze-Calibrate）
點擊OK後出現校準圖，關閉即可
Function：選Uncalibrate OD
勾選Global calibration，則打開新的照片默認Calibration不用重複操作。
不勾選則每次都需要重複進行Calibrate（校準）
這裡需要解釋一下這一步驟，這一步驟將8點陣圖像的灰度值轉換為未校準的光密度值。
通過這一公式Uncalibrated OD = log10(255 / (255 - Gray Value))所以我們最後得出的值其實是光密度（Optical Density），也就是吸光度。
4、調整閾值，選擇適當的區域（Image-Adjust-Threshold）
統一選取默認值（為了消除不同照片，因為手動選取閾值造成的誤差，最好使用默認的閾值）。不用點擊Apply、Set等按鍵，這時其實已經選中了。
5、設定需要測量的參數（Analyze-Set Measurements）
確認勾選Mean gray value和Limit to threshold（十分重要），點擊OK
6、檢測（Analyze-Measure）
Mean即為平均熒光強度。（Mean即Mean value，等於IntDen/Area）
IntDen=Integrated Density（光密度總和）
可以將結果複製到Excel或者直接導出生成csv文件（Results窗口-File-Save as）
這樣我們就得出了圖片的平均熒光強度，但需要注意的是：免疫熒光是半定量分析，平均熒光強度只能半定量地表徵特異性蛋白的表達。
主要是因為免疫熒光實驗中的人為因素太多，例如拍照時的曝光、焦距等等，而且非特異性結合的因素也不能完全消除。所以我們在拍照的時候，以及處理數據的時候，一定要有一個固定的標準和流程，從而減小誤差。
推薦閱讀：