ImageJ實用技巧——自動細胞計數(解放雙手篇)
對於生物狗和密集恐懼症患者來說，手動數細胞是一個極其無聊以及耗費精力的工作。
扯遠啦~上一篇為大家介紹了ImageJ的安裝，以後的文章我會以實際應用的方式，解釋ImageJ各種目錄以及功能。
這是解放雙手篇的第一篇——利用ImageJ實現自動細胞計數。我也會介紹一下多種細胞手動計數的方法。
一、自動細胞計數
1、打開想要處理的圖像（File-Open，或者將圖片直接拖動到菜單欄）
我們的目標是：自動對DAPI染色的細胞核進行計數，得到細胞核的總數。
2、將圖像轉為8-bit（Image-Type-8-bit）
RGB格式簡介：一般彩色的熒光圖片都是RGB格式的。RGB代表紅、綠、藍三種顏色，可以通過這三種顏色的疊加得到各式各樣的顏色。
而RGB的每個通道各有256級亮度，用數字表示為從0、1、2...直到255。在0時最弱，而在255最亮。
例如，純紅色的R值為255，G值為0，B值為0，即（255,0,0）。灰色的R、G、B三個值是相等的（除了0和255）；黑色的R、G、B都為0,；白色的R、G、B都為255。
按照計算，256級的RGB色彩總共能組合出約1678萬種色彩，即256×256×256=16777216。也稱為24位色(2的24次方)。
當我們把一個RGB圖像，轉換為8-bit圖像時，其實就是來了一個簡單的縮放。使用以下公式轉換為灰度：
[灰色=（紅色+綠色+藍色）/ 3] 或 [灰色= 0.299×紅色+ 0.587 ×綠色+ 0.114×藍色]
轉換為8-bit之後，每個像素僅僅只有一個通道，有256級灰度，即0~255，表示亮度從深到淺，對應圖像中的顏色為從黑到白。
3、反轉圖像（Edit-Invert）
這一步其實不是必需的，只是為了更清楚的識別細胞。
4、調整閾值，去除背景，選中細胞核（Image-Adjust-Threshold）
因為我選擇的是B&W（Black and White），所以變為黑色的區域就是已經選中的區域。
（1）這時候會發現Threshold有兩個調節框，拖動上面一條向右移動可以去除比例尺（因為自動計數可能會把比例尺也當做細胞來統計）
（2）拖動下面一條向右適當移動，可以增加選中區域，但要注意在選中細胞核的同時，儘可能少的減少背景。拖動完成後點擊Apply，這是閾值就設置好了。
5、填補細胞核的空隙（Process-Binary-Fill Holes）
在調節閾值減少背景的同時，可能細胞核的一些不均勻部分也被減弱了，可以填補空隙，使得細胞核變成實心球形。
6、打斷細胞核的重疊部分（Process-Binary-Watershed）
細胞密度比較大時，通常會有細胞重疊或者貼近的情況。可以利用Watershed自動識別重疊部分，並將兩個細胞核分離開來。
7、自動分析、計數顆粒（Analyze-Analyze Particles）
出現Analyze Particles界面，通過不同的情況設置參數，最重要的是紅框中的參數。
Size：200-Infinity——指分析顆粒尺寸大於200，一直到無窮大的顆粒。（根據細胞大小，以及結果好壞來更改）
Circularity：0.00-1.00——指圓度，可以根據細胞形狀，調整需要的圓度，1.00為標準圓。
Show：Outlines——指分析結果會展示出顆粒的外框。
Exclude on edges——處於邊緣的顆粒不計入
設置完成後，點擊OK，即出現以下結果：
可以看到最後統計出的細胞核數為151，且每個細胞核的面積也在Results中顯示出來。
注意：自動計數並不是完全準確的，如果發現自動計數與實踐明顯出現偏差，出現多數或者漏數，需要優化閾值（Threshold）和顆粒尺寸的判斷標準（Size以及Circularity）。並且形狀無規則的細胞，例如神經細胞，不適於自動計數，需要手動計數，所以接下來介紹一下利用ImageJ進行手動細胞計數。
二、手動細胞計數
主要有兩種方法：
1、Multi-point工具
雙擊可以更改點的形態、顏色和大小。使用的時候直接點擊細胞，就會自動的標號。但對於多種細胞類型分別計數，並不是很便捷。
2、Cell Counter插件
這就顯示出Fiji，相對於傳統的ImageJ的優勢了。基本能用上的插件，都已經包含在程序中，只需要搜索即可。例如我們在搜索框中輸入：Cell，即可出現Cell Counter這個插件的選項。選中後，點擊Run即可。
然後就會出現Cell Counter插件的界面，可以對多種細胞進行計數，並且在同一圖像中顯示出來。具體的應用其實非常簡單，在這裡就不再贅述了。
細胞自動計數和手動計數，大概介紹完了。如果想熟練掌握，可以隨便百度一張紅血球計數板的照片，按照上面的步驟一步一步操作即可。如果有其他問題，可私信解答~
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