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紙板味真的是氧化造成的么？ 探索反二壬烯醛產生機理

03-19

最近偷懶了，拖延症發作嚴重。本次文章是風味屋釀酒師，跟我同期參加 BJCP風味考試的安林提出的問題。他覺得反二壬烯醛並不是所謂的「氧化味」，所以順著他的思路我做了一些調查。

反二壬烯醛（Trans-2-nonenal 或 E-2-nonenal，以下簡稱E2N）。通常而言就被描述為紙板味，是老化啤酒里常常會聞到的味道。當然，這是教科書上面告訴我們的。我們並不十分了解紙板味是什麼味道，也不知道為什麼老化啤酒為什麼會有它的產生。這是啤酒風味的另外一個新專題，讓我們認識一下E2N。

先長話短說，結論在先。所謂的紙板味，也就是E2N，它的確是氧化帶來的味道，但並不是傳統意義上的啤酒儲藏導致氧化的味道。

E2N特性

E2N在啤酒領域裡通常被認為是「紙板味」（Cardboard Flavor）。但其實它是一些植物的主要氣味來源，例如黃瓜。上世紀60到90年代，就有針對黃瓜的氣味研究，發現是包含E2N在內的幾種醛（Aldehyde）。所以很多非啤酒相關的資料會把E2N描述為「黃瓜味」。[1]

令人意外的黃瓜味

除此之外，E2N也是麵包味的主要組成部分。這裡的E2N主要是美拉德反應的產物。[16]同時研究表明，E2N也是「老人味」的主要味道來源。[17]

E2N並非什麼洪水猛獸，令它成為啤酒人口中的危險品，是因為他的氣味閾值過低，容易察覺。根據氣味試劑製造商Aroxa提供的數據，E2N的閾值在50-250ng/L。[2]再者，它不算一種令人愉悅的氣味，也無法與啤酒相融。才導致大家將其歸類為「缺陷」。

儘管講了黃瓜、紙板、麵包甚至老人味，但依舊太抽象，這個時候只能說：大家喝多點就知道了。

——————以下內容較為晦澀——————

E2N為何會出現在啤酒中？

其實關於E2N的研究自千禧年後逐漸減少，因為已經有辦法十分有效地控制E2N量，所以學界已經對這個課題不太感興趣。所以以下結論均為現階段獲得的結果。

  • E2N主要產生在制麥和糖化步驟中，之後的釀造步驟里會也會檢測到E2N的增加，絕大部分與「壬烯醛潛力」（Nonenal Potential）相關。
  • E2N在制麥與糖化過程中增加E2N的機理相差無幾。
  • E2N的產生機理，分為羥醛縮合反應（Aldol condensation）[5]和氧化，而氧化又分為非酶氧化及酶促氧化。其中酶促氧化反應是E2N來源的大頭。
  • 酶促反應，其相關的酶是脂氧合酶（Lipoxygenase），在麥芽中是指它的同工酶LOX-1。
  • 反應最核心的步驟是，亞油酸（Linoleic Acid，自然存在或者脂質被脂肪酶降解）在LOX-1的作用下分解為9-HPOD ，再經過「9-HPL Like Activity（9-氫過氧剪切酶樣反應）」，降解為E2N。
從脂質到E2N的流程圖

在看了「每個單字看得明白，但一整句話就不知所謂」的解釋後。讓我嘗試更詳細更直白地解釋這個原因。

E2N不是一種成品啤酒的「氧化味」

各種科普資料經常含糊地表達紙板味的來源，例如：啤酒在儲藏過程中由於啤酒里的溶解氧和未排乾淨的空氣導致啤酒老化，出現紙板味...... 然而實質上，在1999年的一份論文就指出：啤酒儲藏中產生的E2N與氧氣沒有關聯。[3]

該論文使用一種很暴力的方法，就是往新鮮啤酒通入96ppm的同位素氧氣（氧-18），然後觀察強制老化（在40攝氏度下存放5日）及自然老化（室溫下存放3個月）後，E2N的增長。

來源：Nonoxidative Mechanism for Development of Trans-2-Nonenal in Beer.[3]

從上面的表格我們可以看出無論注入氧-18與否與E2N的增加並沒有關聯（Relative）。換言之，在成品啤酒中，氧氣的含量與E2N的增加並無關係。那麼與什麼有關？與壬烯醛潛力相關，這個在下篇文章會介紹。在此之前必須要介紹E2N是如何產生的。

E2N產生機理

E2N在制麥和糖化都有可能會產生。其中的機理大致相同。

讓我們追根朔源。在全面研究啤酒的E2N之前，科學家就已經了解到脂質最重會被氧化為各種醛類。最早研究脂質與E2N的關係，來自於各種瓜果蔬菜，黃瓜、甜瓜、香蕉等等。他們了解到這些瓜果的味道是一些醛類物質的表現，尤其是在被切開（或者碾碎）後產生的氣味更為明顯，這個可能與植物自身防衛機制有關，出於自衛而散發出一些令其他生物抗拒的味道。[4]

在一系列研究後，科學家們得知黃瓜（Cucumis sativus）脂質降解為E2N的過程，中間經歷了幾個步驟，其中包括酶促氧化、酶促裂合及酶促異構。其步驟如下：

  • 脂質被脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）水解為亞油酸。
  • 亞油酸在脂氧合酶的催化下降解為一些氫過氧化合物，主要是13-HOPD及9-HPOD。
  • 這些化合物在對應的裂合酶（Lyase）作用下被切割成各種烯醛（Enal），己烯醛，順-3-壬烯醛（Cis-3-noneal）等。
  • 其中順-3-壬烯醛被烯醛異構酶（Enal Isomerase）異構後得到E2N。
來源：The formation of cis-3-nonenal, trans-2-nonenal and hexanal from linoleic acid hydroperoxide isomers by a hydroperoxide cleavage enzyme system in cucumber (Cucumis sativus) fruits. [4]

而在大麥的反應中有著與上圖幾乎相同的途徑。

來源：The chemistry of beer aging – a critical review[5]

在此解釋一下圖裡的幾種化合物，亞油酸是一種雙不飽和脂肪酸，大量存在與各種植物中，我們常用的花生油就包含了32%的亞油酸。[6]

9-LOOH以及13-LOOH，即9-HPOD及13-HPOD。9-HPOD（(10E,12z)-9-hydroperoxyoctadeca-10,12-dienoic acid，(10E,12Z)-9-氫過氧基十八碳-10,12-二烯酸），是一種亞油酸的代謝物，同樣廣泛存在於各種生物中。[7]

而所謂的9-HPL like Activity（9-hydroperoxide lyase-like activity），很有可能是9-HPL（9-hydroperoxide lyase，9-氫過氧裂合酶）與烯醛異構酶的共同反應結果。這個將會在下面講到。

LOX-1

想要從根源性解決問題，就必須從生物的代謝通路入手，下面將解釋在通路中遇到的酶和相關的反應。

儘管降解途徑看起來與黃瓜的代謝很相似，但不同的生物體的酶儘管功能（也就是基因表達）一樣，但基因組成卻不盡一樣。在大麥里的脂氧合酶是LOX1_HORVU。其中HORVU是指大麥的學名Hordeum vulgare的縮寫。部分文獻又有HvLox-1的稱謂，Hv指的也是學名的縮寫。為方便表達，本文還是沿用LOX-1。

LOX-1是一種較為常規的酶，熱敏（即高溫可以滅活），高活性pH範圍為5-8.5。[8]它的主要反應底物（Substrate，指能夠催化的化合物）就是亞油酸鹽（Linoleate），通過氧促反應代謝為9-HPOD。反應式如下[9]：

Linoleate + O(2) <=> (9S,10E,12Z)-9-hydroperoxy-10,12-octadecadienoate

在路徑圖[5]里值得注意的是，產物13-HPOD和9-HPOD都是脂氧合酶的同工酶（對應LOX-1，LOX-2）的產物，但是兩種同工酶的作用不一樣[5]，導致了結果不一樣，所以後期的試驗中，主要以研究如何減少LOX-1為主。

9-HPL

除了討論脂氧合酶外，在生成E2N之前還有兩個兩個重要的步驟，裂合與異構。裂合是9-HPOD降解為醛類的必經步驟。其中為了裂合9-HPOD，有種專門針對它的裂合酶——9-HPL。

9-HPL屬於細胞色素P450這個超家族（Super Family，基因超家族，指由同一個基因複製及變異得來的一大組基因），在這個超家族裡它稱為CYP74C。與CYP74A、CYP74B不一樣的是，9-HPL帶有HPL基因，所以可以裂合氫過氧化合物。[10]

大米（Oryza sativa）中 9-HPL對於 9-HPOD的切割及其切割位置 來源：Metacyc[11]

研究表明，不同植物的9-HPL對於9-HPOD和13-HPOD有著不同的活性，像西瓜就兩樣都有相同活性，但番石榴的9-HPL就只對9-HPOD有活性。[10]

烯醛異構酶

目前只是假設可能有異構酶的存在。05年，Hisao Kuroda（來自札幌啤酒廠價值創造先鋒實驗室）檢測到在整個9-氫過氧剪切酶樣反應，產物從Z3N（3Z-nonenal，即cis-3-nonenal，順-3-壬烯醛）到E2N的過程。其中，Z代表著順式（cis），E代表著反式（trans）。

順式結構的化合物轉變為反式結構的化合物，一般順-反式異構酶（cis-trans isomerae）。而在這個特例里，涉及到的是3Z:2E烯醛異構酶（3Z:2E enal isomerase）。

來源：Characterization of 9-Fatty Acid Hydroperoxide Lyase-Like Activity in Germinating Barley Seeds That Transforms 9(S)-Hydroperoxy-10(E),12(Z)-octadecadienoic Acid into 2(E)-Nonenal.[12]

從上圖可以看到Z3N在前半段，而E2N位於整個9-氫過氧剪切酶樣反應中的後半部分。而成品的反應產物並未檢測到Z3N的存在，所以Kuroda就提出類9-HPL活性里包含3Z:2E烯醛異構酶的假設，但試驗中無法分離提出異構酶。而他及後來者並沒有繼續嘗試分離。

來源：Characterization of 9-Fatty Acid Hydroperoxide Lyase-Like Activity in Germinating Barley Seeds That Transforms 9(S)-Hydroperoxy-10(E),12(Z)-octadecadienoic Acid into 2(E)-Nonenal.[12]

假設這個假說成立，那麼這個亞油酸的降解途徑就與黃瓜相似了。盡然Kurodo沒辦法提純出異構酶，但我們可以用黃瓜的異構酶進行類比。目前所知，黃瓜的3Z:2E烯醛異構酶，pH5.5-9.5時，活性有50%以上。[8]

制麥過程中的E2N產生

制麥（Malting）過程中產生的E2N的機理與糖化一樣。只是環境狀態不同，產生的量有所不同。

制麥的過程一般分為三個步驟：浸泡（Steeping）、發芽（Germinating）和烘烤（Kilning）。這些一般與家釀愛好者有些距離，但對於大酒廠而言，控制這些變數是必須的。

儘管上面寫了很長的關於糖化的E2N反應，但實質上E2N產生最多是在發芽階段。這些E2N最終會潛伏於麥芽中，從而一直帶到成品啤酒里，這就是上面所講的壬烯醛潛力。我國科研人員通過GC-MS監測從大麥到麥芽的整個發芽過程E2N的變化。可以從下面的表格看到最終發芽時E2N含量很高。[13]

來源： Analysis of volatile compounds from a malting process using headspace solid-phase micro-extraction and GC–MS. [13]

而烘烤的過程，上面就提到LOX-1酶是一種熱敏酶[8]，在高溫的烘烤環境下酶處於低活性。所以這一個階段鮮有新的E2N產生（不排除美拉德反應帶來新的E2N，但數量不多）。有論文指出在高溫加熱狀態下（儘管論文里是指煮沸麥芽汁的狀態），會釋放一部分潛伏的E2N[3]，這個我們下一篇細說。

而整個制麥過程的LOX-1酶活性如下圖。可以看到LOX-1活性下降了約90%。[14]

來源：Producing Quality Barley for the Malting Industry[14]

其他可能影響到E2N產生的因素

麥芽品種

不同麥芽品種的LOX-1酶活性不一，甚至9-HPL及順-反式異構酶活性都不一樣。研究人員就嘗試收集不同品種的大麥及對應的麥芽來檢測E2N含量。不過比較遺憾的是，研究並不是實驗者自己去控制變數發芽；而且並未檢測壬烯醛潛力值。

來源：Optimization of Modern Analytical SPME and SPDE Methods for Determination of Trans-2-nonenal in Barley, Malt and Beer. [15]

研磨度及麥芽水比

瑞典的研究人員在研究糖化中E2N的變化模型時，將麥芽水比及麥芽研磨度考慮了進去。[16]

來源：Trans-2-nonenal During Model Mashing.[16]

可以觀察到麥芽水比到某個階段後，E2N的含量逐漸穩定，而LOX-1酶活性也趨向穩定。而研磨度越高的麥芽，E2N及壬烯醛潛力更高。

溫度與pH值

溫度和pH值不僅影響LOX-1的活性，同時影響9-HPL和烯醛異構酶的活性，這裡是一個總體的表現。

同樣是上面提到的實驗人員。他們收集常用的幾個糖化溫度里的麥芽汁，檢測E2N的產生。可以看到溫度對E2N的產生影響十分大。

A：37°C，B：68°C，C：77°C 來源：Trans-2-nonenal During Model Mashing. [16]

同時他們也做了pH值對E2N產生的影響研究。可以看到pH值越低E2N產生越小。

來源：Trans-2-nonenal During Model Mashing. [16]

而在實際釀酒操作中：

  • 麥芽研磨度一般都在中等範圍。
  • 麥芽水比為1:1.5到1:5，單位kg/L。
  • 糖化溫度基本在上述提到的幾個溫度上下浮動。
  • 唯一可以變的是pH值，但pH值牽一髮而動全身，況且大部分情況下，糖化的pH都高於5.2。

所以，其實大家並沒有太大的空間在常規的釀造過程中控制E2N的數量。所以大家並不需要在意怎麼通過提高手法/技藝來避免E2N。

本篇文章主要介紹了E2N的產生機理，和一些影響E2N產生數量的因素。但並未涉及到「解決方案」。下一張會詳細介紹壬烯醛潛力及一些阻止E2N產生的方案。

-EOF-

參考資料：

1 Flavornet

flavornet.org/info/1882

2 Aroxa

aroxa.com/beer/beer-fla

3 Nonoxidative Mechanism for Development of Trans-2-Nonenal in Beer.

4 The formation of cis-3-nonenal, trans-2-nonenal and hexanal from linoleic acid hydroperoxide isomers by a hydroperoxide cleavage enzyme system in cucumber (Cucumis sativus) fruits.

5 The chemistry of beer aging – a critical review

6 Linoleic acid

en.wikipedia.org/wiki/L

7 9(S)-Hpode

pubchem.ncbi.nlm.nih.gov

8 Purification and characterization of two lipoxygenase isoenzymes from germinating barley.

9 Brenda

brenda-enzymes.org/enzy

10 Hydroperoxide lyases (CYP74C and CYP74B) catalyze the homolytic isomerization of fatty acid hydroperoxides into hemiacetals

11 Metacyc

biocyc.org/META/NEW-IMA

12 Characterization of 9-Fatty Acid Hydroperoxide Lyase-Like Activity in Germinating Barley Seeds That Transforms 9(S)-Hydroperoxy-10(E),12(Z)-octadecadienoic Acid into 2(E)-Nonenal.

13 Analysis of volatile compounds from a malting process using headspace solid-phase micro-extraction and GC–MS.

14 Producing Quality Barley for the Malting Industry

15 Optimization of Modern Analytical SPME and SPDE Methods for Determination of Trans-2-nonenal in Barley, Malt and Beer.

16 Aroma Chemistry – The Smell of Freshly-Baked Bread

compoundchem.com/2016/0

17 Old person smell

en.wikipedia.org/wiki/O


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