【細胞生物學原創系列一】細胞生物學整體實驗設計
最初接觸細胞生物學相關的課題或者項目時，往往不知道從哪些方面去入手研究，如實驗如何設計，使用哪些方法，檢測哪些指標等。尋找和閱讀相關文獻是我們最常用的方法，對於有豐富經驗的同學來說，相對比較輕鬆；對於初學者，可能需要花費較多的精力和時間。在這裡給大家分享一些細胞生物學實驗中常用的研究思路和方法，希望對初學者會有所幫助。
下圖展示了細胞生物學實驗常用的研究思路和方法。
下面會按照細胞生物學實驗的思路，對其中各要素逐個進行梳理。
細胞生物學實驗的基礎是細胞培養，細胞狀態好才有可能供我們使用，去完成下游的實驗，比如最常見的細胞轉染，藥物處理等。那麼細胞培養的概念是什麼（這裡所涉及到的細胞均為動物細胞）。
1. 什麼是細胞培養？
指從動物活體體內取出組織，並將其分散為單個細胞（機械或酶消化），在體外模擬體內的生理環境，使其在人工培養條件下保持生長、分裂繁殖、細胞的接觸性抑制以及細胞衰老過程等生命現象。
最常見的細胞一般有兩種，一種是原代細胞，另一種是傳代細胞。
原代細胞是指動物組織經過胰酶或膠原酶等酶類的消化，使其分散，從而獲得單個細胞，再使這些單個細胞生長於培養容器中的過程。大多數組織可以製備原代細胞，但製備的方法略有不同，製備的細胞生長快慢及難易程度也不相同。大體製作流程如下（不同的原代細胞製作過程會略有不同）：
（1）取組織，放入平皿中。用無Ca2+、Mg2+的PBS洗組織2－3次。
（2）剪碎胚體，用用無Ca2+、Mg2+的PBS振蕩洗滌，靜置片刻，待胚塊沉澱後吸去上清，重複3次。
（3）加胰酶（終濃度0.625%），置37℃消化至胚塊「起毛」（大組織塊邊緣似纖毛運動）。
（4）棄上清，加入含小牛血清的Hank』s液，用滴管反覆吹打至見不到組織塊。
（5）用200目細胞篩過濾至刻度尖底離心管中，離心10 min。
（6）棄上清，加入少量生長液吹散細胞沉澱，按細胞壓積（1:300）加生長液，分裝入細胞培養瓶，置培養箱培養。
不同的原代細胞，其形態也不盡相同。一般將10代以內的細胞稱之為原代細胞。
傳代細胞一般指無限繁殖的細胞系，理論上這類細胞可以無限次的傳代。做實驗的時候也會經常使用這類細胞，如Hela、 293、Vero等細胞。
2. 細胞的生長周期
每代細胞的生長周期（這裡以使用較多的貼壁細胞為例）一般分為遊離期，貼壁期，潛伏期，對數生長期，停止期。
遊離期：細胞剛接種到新的培養容器中到貼壁前的一段時期，這個時期的長短由細胞類型決定，從幾分鐘到幾個小時不等。
貼壁期：細胞從遊離狀態變為貼附到培養器皿表面並展現出一定細胞形態的時期。
潛伏期：細胞在完成貼壁後，並不會馬上進行增殖，會進行增殖所必須的物質和能量的儲備，這個時候稱之為潛伏期。
對數生長期：細胞在完成物質和能量儲備後，開始大量的增殖的時期。這個時期的細胞活力旺盛，且狀態穩定，我們所做的絕大多數實驗都是在這個時期開展的。
停止期：隨著細胞的生長，細胞密度越來越大，由於營養物質的消耗、細胞間的接觸抑制等因素，細胞生長緩慢，甚至停止生長。這個時候，我們就要給細胞進行傳代了，使細胞可以繼續進行增殖，保持旺盛的活力。
3. 細胞生長所需要營養條件
細胞的培養所需要的營養成份一般來自於基礎培養基（比如DMEM培養基）和血清。
基礎培養基：主要是提供細胞生長所需要的氨基酸（組成蛋白質的基本單位）、維生素（細胞代謝中輔酶的組成成分）、無機離子（K+，Na+等）、碳水化合物（碳源和能量來源）和一些激素等營養物質。
血清：主要是提供一些基礎培養基不能提供的生長因子和低分子的營養物質，此外它還有促進細胞的貼壁、中和有害重金屬離子等作用。
如果只提供基礎培養基而不提供血清，絕大多數細胞是無法生長的。血清對於我們實驗的重要性就不言而喻了，那麼什麼樣的血清才算是合格的血清呢？
合格的血清需要通過各種檢測，包括無細菌，無真菌，無支原體檢測，無病毒污染。血清一般呈現為淡黃色，透明狀液體，由於含有大量的蛋白質等成分，會略有黏稠。以全式金公司的TransSerum? EQ Fetal Bovine Serum (FS201-02)為例，它通過了牛腹瀉病毒、牛副流感病毒、牛呼腸孤病毒、狂犬病病毒、牛腺病毒、牛細小病毒和支原體的檢測，安全可靠。以澳洲健康胎牛血液為原料加工而成，經3 次0.1 μm 微孔濾膜過濾，無支原體污染，內毒素水平極低。同時呢也適用於間充質幹細胞的培養。下表列出了使用EQ血清培養過的部分細胞，供大家參考。
除了基礎的培養基和血清以外，在培養細胞的時候可能還會用到一些其它的試劑，比如消化貼壁細胞必備的Trypsin（FG301-01 或FG301-11），常見的緩衝液PBS（FG701-01），雙抗Penicillin-Streptomycin（FG101-01）等。
4. 影響細胞生長的因素
對細胞生長影響比較多的點主要有以下三個方面：
（1）細胞的營養來源：主要是指血清和培養基，培養基只要根據細胞種類不同選擇不同的基礎培養基即可，相對比較簡單。血清遇到的問題比較多，我們這裡著重介紹一下。
我們實驗中用得比較多的血清是胎牛血清，血清是一種非人工的產品，成分複雜，偶爾出現沉澱屬於正常現象，這個在各個品牌的血清產品中都有可能出現。這些出現的沉澱主要是蛋白質，鹽類和脂肪酸等成分的析出，在我們將血清配製成完全培養基以後，這些成分還有可能再溶解到培養基中，並不會對血清促進細胞生長的作用產生明顯的影響。這裡要強調一下的是，要把血清中出現的絮狀沉澱和血清污染區分清楚，後者是萬萬不能用的。
在日常使用中，很多情況下都有可能增加血清中的沉澱，比如熱滅活、反覆凍融、融化中沒有搖勻、γ射線照射、長期存放在2-8℃等。說到血清的融化，有必要強調一下，切勿將剛剛從-20℃冰箱里拿出來的血清直接放在室溫的或者37℃的水浴，因為在水浴中血清迅速融化，很大的溫差極易造成血清產生沉澱。建議血清從-20℃冰箱取出後，於2-8℃解凍過夜，注意溶解過程中必須不時搖動使之溶解均勻。血清融解後，分裝成我們需要的小份-20℃長期保存即可。
另一個我們常聽到的血清處理方法是熱滅活，什麼是熱滅活呢？熱滅活主要是滅活血清中的補體，一般滅活條件為56℃，30分鐘處理已解凍的血清。實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。因此若非必需，不需要做熱處理這一步。如此一來，不但節省寶貴時間，更確保血清的質量。但在有些實驗中，比如免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞的培養中,推薦使用熱滅活血清，因為補體的存在會顯著的影響到這些實驗的結果。
（2）氣體和pH：氣體也是細胞生存的必需條件之一，所需氣體主要是氧和二氧化碳。在開放培養時，一般置細胞於95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環境中培養。動物細胞大多數需要輕微的鹼性條件，pH值約在7.2-7.4。我們現在使用的大部分緩衝系統都是碳酸氫鈉緩衝系統，結合一定濃度的二氧化碳，可提供更有效的緩衝體系，主要是防止pH值迅速變動。
（3）溫度：培養細胞的最適溫度相當於各種細胞或組織取材機體的正常溫度。人和哺乳動物細胞培養的最適溫度為35℃-37℃。如果溫度過高或者過低都會對細胞的生長、生存狀態有明顯的影響。溫度不超過39℃時，細胞代謝強度與溫度成正比；細胞培養置於39℃-40℃環境中1 h，即受到一定損傷，但仍能恢復；當溫度達43℃以上時，許多細胞將死亡。當溫度下降到20-30℃時，細胞代謝降低，因而與培養基之間物質交換減少。所以為了保持細胞的良好生長環境，我們儘可能的使它們在適宜的溫度下生長。
以上是本期為您介紹的細胞生物學實驗整體實驗設計中細胞培養部分內容，好的研究思路和方法對我們實驗的開展至關重要，今天就同大家分享到這裡，我們下期見，祝大家科研順利！
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