染色質免疫共沉澱（ChIP）實驗方法及步驟詳解

03-14

實驗方法原理

在保持組蛋白和DNA聯合的同時，通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體，染色質被切成很小的片斷，並沉澱下來。

IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的「prorein A」特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象活用開發出來的方法。

目前多用精製的prorein A預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應後，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精製的目的。

實驗材料

細胞樣品

試劑、試劑盒

甲醛甘氨酸PBSSDS Lysis Buffer洗脫液RNaseA蛋白酶Komega膠回收試劑盒

儀器、耗材

離心管超聲儀電泳儀離心機

實驗步驟

一、細胞的甲醛交聯與超聲破碎（第一天）

1. 取出1平皿細胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（培養基共有9 ml）。

2. 37℃孵育10 min。

3. 終止交聯：加甘氨酸至終濃度為0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸於平皿中。混勻後，在室溫下放置5 min即可。

4. 吸盡培養基，用冰冷的PBS清洗細胞2次。

5. 細胞刮刀收集細胞於15 ml離心管中（PBS依次為5 ml，3 ml和3 ml）。預冷後2 000 rpm 5 min收集細胞。

6. 倒去上清。按照細胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細胞終濃度為每200ul含2×106個細胞。這樣每100 ul溶液含1×106個細胞。再加入蛋白酶抑製劑複合物。假設MCF7長滿板為5×106個細胞。本次細胞長得約為80%。即為4×106個細胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800 ul。

7. 超聲破碎：VCX750，25%功率，4.5 s衝擊，9 s間隙。共14次。

二、除雜及抗體哺育（第一天）

1. 超聲破碎結束後，10 000 g 4℃離心10 min。去除不溶物質。

2. 留取300ul做實驗，其餘保存於-80℃。

3. 300 ul中，100 ul加抗體做為實驗組；100 ul不加抗體做為對照組；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M），65℃處理3 h解交聯，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。

4. 在100 ul的超聲破碎產物中，加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。

再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃顛轉混勻1 h。

5. 1 h後，在4℃靜置10 min沉澱，700 rpm離心1 min。

6. 取上清。各留取20 ul做為input。一管中加入1 ul抗體，另一管中則不加抗體。4℃顛轉過夜。

三、檢驗超聲破碎的效果（第一天）

1. 取100 ul超聲破碎後產物，加入4 ul 5M NaCl，65℃處理2 h解交聯。

2. 分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。

四、免疫複合物的沉澱及清洗（第二天）

1. 孵育過夜後，每管中加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃顛轉2 h。

2. 4℃靜置10 min後，700 rpm離心1 min。除去上清。

3. 依次用下列溶液清洗沉澱複合物。清洗的步驟：加入溶液，在4℃顛轉10 min，4℃靜置10 min沉澱，700 rpm離心1 min，除去上清。

洗滌溶液：

（1）low salt wash buffer-one wash

（2）highsalt wash buffer-one wash

（3）LiCl wash buffer-one wash

（4）TE buffer-two wash

4. 清洗完畢後，開始洗脫。

洗脫液的配方：100 ul 10%SDS，100 ul1M NaHCO3，800 ul ddH2O，共1 ml。

每管加入250 ul洗脫buffer，室溫下顛轉15 min，靜置離心後，收集上清。重複洗滌一次。最終的洗脫液為每管500 ul。

5. 解交聯：每管中加入20 ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M）。

6. 混勻，65℃解交聯過夜。

五、DNA樣品的回收（第三天）

1. 解交聯結束後，每管加入1 ul RNaseA（MBI），37℃孵育1 h。

2. 每管加入10 ul 0.5 M EDTA，20 ul1M Tris.HCl（PH6.5），2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃處理2 h。

3. DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶於100 ul ddH2O。

六、PCR分析（第三天）

注意事項

1. 注意抗體的性質。抗體不同和抗原結合能力也不同，免染能結合未必能用在IP反應。建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。

2. 注意溶解抗原的緩衝液的性質。多數的抗原是細胞構成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩衝液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強界面活性劑的緩衝液，儘管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果。

3. 為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩衝液必須加蛋白每抑製劑，低溫下進行實驗。每次實驗之前，首先考慮抗體/緩衝液的比例。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩衝劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。