引物設計軟體哪家強？快速獲取有門道

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提及PCR，這可是實驗室里的老朋友了。作為科研升級打怪之路上的第一道最基本關卡，初踏進科研界的實驗狗們，又有哪個沒有與之打過交道？可饒是如此，不少菜鳥在闖關時仍會被摔的鼻青臉腫，原因無他，引物設計不好之過矣。

顯然，欲過此關，則必先通過引物設計的試煉。好在網上流傳著各類PCR引物設計軟體，各顯神通後可快速為大家設計出最佳引物，以助大家一臂之力。而本文也搜集一籮筐各具特點的引物設計軟體，大家按自己的需要進行選擇即可。

經典款

1.Primer Premier

Premier是由加拿大的Premier公司開發的專業用於PCR或測序引物以及雜交探針的設計和評估的軟體，應該是使用範圍最廣的一款軟體了。主要界面有序列編輯窗口（Genetank），引物設計窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和 Motif 分析窗口。

Primer Premier軟體的主要功能分四種，即引物設計、限制性內切酶位點分析、DNA 基元(motif)查找和同源性分析功能。前三種為其主要功能。

此外，該軟體還有一些特殊功能，其中最重要的是設計簡併引物，另外還有序列"朗讀"、DNA 與蛋白序列的互換、語音提示鍵盤輸入等等。（文章鏈接：PrimerPremier 6安裝、破解、引物設計實操攻略）

2.Oligo7

該軟體主要應用於核酸序列引物分析設計，同時計算核酸序列的雜交溫度（Tm）和理論預測序列。作為目前最好、最專業的引物設計軟體，Oligo的功能很強，其主要功能包括：普通引物對的搜索、測序引物的設計、雜交探針的設計以及評估引物對質量等等。它的引物分析功能如此強大以至於能風靡全世界。（文章鏈接：乾貨 | Oligo設計引物，就是這麼簡單）

3.Beacon Designer

Beacon Designer是一款功能強大且簡單易用的Real-time PCR引物設計的必備武器。它可在目的基因的任意位置中定位引物，比如跨內顯子-內顯子或外顯子-外顯子設計引物，適用於SYBRGreen試驗設計。此外，它可用於HRMA試驗設計、雙標籤探針設計（如TaqMan? 探針、分子信標 、Scorpions引物和探針 、FRET探針）。

在線款

1.NCBI的Primer-Blast

通常用另一個站點或工具設計好引物後，還得用BLAST進行引物特異性驗證。但這個工具整合了目前流行的Primer3軟體，同時也能通過NCBI的Blast進行引物特異性的驗證，比較快捷方便。

且該工具還可針對某一特定剪接變異體基因來設計引物——這是用來衡量基因在特定組織中特異性表達的重要特徵。此外，Primer-BLAST有許多改進的功能，比單個的用Primer3和NCBI BLAST更加準確。

Primer-Blast的界面包括4個部分：PCRTemplate（模板區），Primer Parameters（引物區），Exon/intronSelection（外顯子內含子設置）和specificity check（特異性驗證區）。

網址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/或者直接從Blast主頁（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）上找到。

2.Primer3 Plus

Primer3是一個非常簡單卻高效的引物設計在線軟體。你只需在目標序列中粘貼DNA序列後點擊搜索即可。其中，可通過多種方式來對結果進行篩選，包括PCR產物的大小、引物大小、Tm範圍和其他參數。同樣，還可使用Primer3來設計用於PCR-ELISA的雜交探針和其他基於探針的PCR引物設計。

另外，嚴格的qPCR引物設計一般要求其中一條引物要跨外顯子，最好在3『端設計引物，產物的長度在300bp以內等。本在線軟體可滿足qPCR引物設計的要求。

網址：http://www.primer3plus.com/

3.BathPrimer3.0

BathPrimer3.0是由加州大學戴維斯分校的研究人員設計的一個基於Primer 3為核心開發的引物設計工具，可設計多種引物，包括通用引物，SSR引物設計和SSR檢測和SNP基因分型引物，以及DNA測序引物，當然它最大的特點是可以一次設計500條序列引物，並且是在線和完全免費的，而且速度也是杠杠的。

網址：https://wheat.pw.usda.gov/demos/BatchPrimer3/

4.The PCR Suite

這是基於Primer3的基因引物設計的四套程序，可用於設計重疊引物（Overlapping Primers），即在一個序列中創建多個重疊的PCR引物；只需要一個包含目的基因的GenBank文件，即可在基因組序列的外顯子周圍設計引物（Genomic Primers）、每個SNP上設計引物（SNPPrimers ）、在開放閱讀框架上設計引物（cDNAPrimers）

5.Primerbank

哈佛大學的一個qPCR引物資料庫，目前有超過20萬條引物，涵蓋了人和小鼠大部分已知的基因。根據網站上對兩萬多對引物的驗證結果，引物有效率為82.7%。盡量選擇這種驗證過的qPCR引物，qPCR品質比較有保障。（文章鏈接：乾貨 | PCR引物設計，3款在線軟體就能搞定！）

網址：http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

6.PrimerX

PrimerX可用於自動設計用於定點誘變的誘變PCR引物，節省時間提高效率。基於你所輸入的序列，PrimerX將模板DNA序列與已經包含所需突變的DNA或蛋白質序列進行比較。然後通過計算編碼該突變的適當長度的所有可能的寡核苷酸序列，並遵循指定的指令來產生正向引物序列。最後，PrimerX產生相應的反向引物序列，並計算其他必需信息，如每個引物對的解鏈溫度和GC含量。

網址：http://bioinformatics.org/primerx/

7.BiSearch

特別推薦該軟體設計用於擴增高度冗餘的亞硫酸氫鹽處理的序列的引物。ePCR工具可快速檢測cDNA文庫和天然或亞硫酸氫鹽處理的基因組中的錯配位點和替代PCR產物。

網址：http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch

快速獲取通道

辣么多的引物設計軟體，鬧哄哄、你方唱罷、我登場，倒是給人一種亂花漸欲迷人眼的感覺。可即便如此，有些被繞花眼的小夥伴依然在PCR之海中浪不起來，被PCR引物狠狠地拍在岸上。

而這歸根到底是因為他們忽略了一點——無論自己設計引物還是交給公司設計引物，只要是設計，其過程就是探索；只要是探索，就必然伴隨著不確定性。並且任何引物設計軟體都只是依據相應參數、演算法來進行計算、預測，因此得到的引物僅在理論上是最優的，並不代表實際實驗一定能出結果。

因此，一對引物究竟好不好用，還是需要通過實驗來驗證的，所謂「實踐是檢驗真理的唯一標準」。而就小編而言，私認為獲得良好PCR引物比較科學的流程，應如下圖所示：

圖中，獲取引物的四種方法：顏色越偏綠，實驗成功率越高；顏色越偏紅，實驗成功率越低，但得到引物序列的概率越高。

顯然，每個小夥伴做實驗都是依託於實驗室這個大平台，那麼很有可能你所研究的基因是課題組以前做過的，甚至還有可能發過論文的。都說人有一張嘴，除了吃，就是說。此時，需要引物的你大可以直接詢問自家的師兄師姐。掌握要訣：師妹靠賣萌，師弟靠幹活~

另外，書中自有黃金屋，這話也是很有道理的。要研究某個基因，怎能不讀幾篇相關文獻呢？而且很有可能某篇文獻中就已經提供了該基因的熒光定量引物，而該引物還是經過作者驗證和期刊評審機構核實過的，八成是可以給你帶來完美的結果。

如果你研究的基因比較小眾，茫茫文獻中很難釣到提供目的基因引物序列的文章，那就只能轉戰資料庫了。比如上文推薦的資料庫PrimerBank，就可以提供相關基因的qPCR引物。但如果上述三種方法都沒能成功，小夥伴們就不要再抱著僥倖心理了，還是老老實實設計引物吧。

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