直擊ASCO 2018：PD-1及其聯合治療靶點作用機制

六月，

對於大多數人來說，

也許是高考月，

也許是購物月。

然而，

在科研界，

尤其是腫瘤醫學方面，

六月，

最重要的是一場盛會-ASCO。

ASCO是美國臨床腫瘤協會（American Society of Clinical Oncology）的簡稱，由來自100多個國家的40000多名會員構成，包括腫瘤學領域及臨床腫瘤領域專家、腫瘤科護士以及腫瘤科執業醫師。ASCO每年都將在年中的時候舉辦年會。ASCO 2018有超過32000名的腫瘤專家參會。

獨佔鰲頭：PD-1/PD-L1

ASCO 2018收到的摘要有5054篇，其中關於PD-1/PD-L1研究的文章高達679篇。由此可見，PD-1/PD-L1在腫瘤研究與治療方面有多麼的火熱。在所有的免疫檢查點中，PD-1/PD-L1已經脫穎而出，在許多惡性腫瘤中成為治療靶點。現在全球開展的臨床試驗超過1000多項，並已經被批准用於一些癌症治療中，如非小細胞肺癌（NSCLC）、腎細胞癌（RCC）、霍奇金氏淋巴瘤（HL）、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）、默克爾細胞癌（MCC）、微衛星不穩定性（MSI）或錯配修復缺陷型（MMR）引發的實體瘤。

為什麼PD-1/PD-L1在腫瘤治療中如此受重視呢？

先從免疫檢查點機制開始說起。

免疫檢查點（Immune checkpoint）機制可以控制免疫反應的強度和持續時間，減少免疫應答對健康組織的傷害，避免過度活躍免疫應答導致的炎症反應和自身免疫性疾病。免疫檢查點就像人體免疫系統中的「剎車器」，防止T細胞過度激活，進而引發炎症損傷等，起著保護作用。但是腫瘤細胞有點「狡猾」，可以利用這一機制，過度的表達免疫檢查點分子，使人體免疫反應受到抑制，從而產生「免疫逃逸」，讓其可以生長、增殖。目前，研究和應用最廣泛的免疫檢查點抑製劑為PD-1/PD-L1和CTLA-4。

免疫檢查點

PD-1屬於CD28家族成員，與毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）有20%的同源性。PD-1是由268個氨基酸組成的I型跨膜糖蛋白，它的結構主要包括胞外免疫球蛋白可變區（IgV）樣結構、疏水的跨膜區以及胞內區。胞內區尾部有2個獨立的酪氨酸殘基，氮端的酪氨酸殘基參與構成一個免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif，ITIM），碳端酪氨酸殘基則參與構成一個免疫受體酪氨酸轉換基序（immunoreceptor tyrosine based switch motif，ITSM）。PD-1與PD-L1在激活的T細胞結合後，促使PD-1的ITSM結構域中的酪氨酸發生磷酸化，進而引起下游蛋白激酶Syk和PI3K的去磷酸化，抑制下游AKT、ERK等通路的活化，最終抑制T細胞活化所需基因及細胞因子的轉錄和翻譯，發揮負向調控T細胞活性的作用。

PD-1是程序性細胞死亡蛋白-1，是重要的免疫檢查點。PD-1通過T細胞受體表達於所有T細胞。當抗原被緊急清除後，PD-1表達水平降低，如果抗原沒有被清除，PD-1表達水平就會居高不下（如慢性感染或腫瘤）。初始T細胞活化後，PD-1信號通路調節代謝重組，抑制葡萄糖和谷氨醯胺代謝的上調，促進CD4+ T細胞內的脂肪分解與脂肪酸氧化，通過微環境中的代謝競爭，使T細胞處於低反應狀態，進而促進腫瘤生長。

PD-1/PD-L1免疫抑制機制

PD-1有兩個配體，即PD-L1（又稱為B7-H1/CD274）和PD-L2（又稱為B7-DC/CD273）。兩種配體具有不同的表達模式。PD-L1的表達受到炎症細胞因子如I型和II型干擾素、TNF-α和VEGF等的誘導。PD-L1可以在多種細胞表達，常見於造血細胞，如T細胞、B細胞、DC細胞和巨噬細胞，以及非造血細胞，如血管和間質血管內皮細胞、胎盤合體滋養細胞和角質細胞。相較之下，PD-L2的表達受到很大的限制，主要由DC細胞、巨噬細胞和B細胞表達。

CTLA-4是細胞毒性T淋巴細胞抗原4（也稱CD152），是首先被誘導的負調控因子之一，直接與CD28競爭，與CD80和CD86結合。

T細胞活化是一個高度調節的過程，依靠「雙系統」調控。第一信號來自T細胞受體（TCR）與主要組織相容性複合體（MHC）的特異性結合，即T細胞識別抗原過程。第二信號來自協同刺激分子，即抗原遞呈細胞（APC）表達的協同刺激分子與T細胞表面相應受體或配體相互作用介導的信號。CD28/B7屬於重要的正調控刺激分子，而PD-1/PD-L1和CTLA-4屬於負調控刺激分子，保證T細胞不被過度刺激。正如上所說，在腫瘤細胞入侵後，就會利用這一抑制性通路，抑制T細胞的激活，進而產生「免疫逃逸」。而在臨床上研究和應用最廣泛的免疫檢查點抑製劑的單克隆抗體，通過抑制免疫檢查點的活性，重新激活T細胞對腫瘤的免疫應答，從而達到抗腫瘤的作用。

所有活化T細胞都可表達PD-1，因此它是效應T細胞的標記物。PD-1屬於誘導表達蛋白，只有T細胞活化後，PD-1才會被誘導表達。如果T細胞沒有被激活，幾乎就沒有PD-1表達。PD-1除了在活化成熟的T細胞上表達，還在胸腺的雙陰性（CD4-CD8-）T細胞、耐受性T細胞亞型、調節性T細胞（Treg）、記憶性T細胞、T濾泡輔助細胞（TFH）、T濾泡調節性細胞（TFR），以及活化的B細胞、NK細胞、單核細胞、某些髓樣細胞和癌細胞等多種細胞表達，在未成熟的朗格漢斯細胞上也有低表達。對於PD-1信號通路而言，表達時間、部位、T細胞分化狀態、抗原負荷、炎症水平、代謝狀態以及其他因素共同影響PD-1的功能。PD-1在維持保護性免疫與免疫病理學、動態平衡及耐受性之間的平衡中發揮重要作用。

PD-1/PD-L1抑制信號可以通過多種方式維持免疫系統的平衡。經過PD-1通路的信號有助於調節初始T細胞活化、微調T細胞的死亡和功能、T細胞耐受以及免疫平衡。擾亂PD-1通路會嚴重影響宿主的生理機能。例如，慢性感染和癌症患者常見PD-1及其配體高度持續表達，阻斷PD-1通路可以改善T細胞的功能，減少病毒載量和腫瘤負荷。

PD-1是一種真正獨特的抑制性受體，其調節信號在免疫穩態、炎症、耐受性、慢性感染和癌症中具有重要作用。PD-1信號傳導缺失通常會增強機體對各種感染的免疫控制，有時也會損害宿主免疫力。PD-1通路的關鍵功能是通過促進炎症反應消退和免疫穩態恢復，限制宿主組織免疫病理學應答。它可以調節動脈粥樣硬化引起的炎症反應、記憶性T細胞分化和應答、自身免疫和外周自身反應性T細胞。阻斷PD-1可能改變血管屏障的通透性，增加心臟病發作、中風和水腫風險。時間選擇是確定PD-1阻斷劑是否導致自我耐受故障的關鍵。

腫瘤細胞及腫瘤微環境通過上調PD-L1表達並與腫瘤特異的CD8+T細胞表面的PD-1結合，來限制宿主的免疫反應。腫瘤細胞主要通過以下途徑上調PD-L1表達：1. EGFR、MAPK或PI3K-Akt通路的激活，STAT3蛋白高表達和HIF-1轉錄因子等均可以上調PD-L1的表達；2. 編碼PD-L1的基因擴增（9p24.1）；3. EB病毒的誘導（EB病毒陽性的胃癌和鼻咽癌，沒有9p24.1基因擴增，也可以表現為PD-L1的高表達）；4. 表觀遺傳學的機制等。

PD-1/PD-L1抑製劑的癌症免疫治療機制

在腫瘤微環境中，炎症因子的刺激同樣可以誘導PD-L1和PD-L2的表達，其中Υ-干擾素是最重要的刺激因子。除作用於腫瘤細胞，還可以誘導腫瘤微環境中其他細胞，包括巨噬細胞、樹突狀細胞和基質細胞表達PD-L1和PD-L2；而能夠識別腫瘤抗原的，活化腫瘤浸潤性T淋巴細胞則是Υ-干擾素的重要產生者，這一過程被稱為「適應性免疫抵抗」，通過這一機制，腫瘤細胞實現自我保護。圖3顯示了腫瘤細胞如何通過PD-1／PD-L1信號通路抑制腫瘤特異性T細胞功能。

因為PD-1僅在活化的T細胞表達，因此PD-1/PD-L1/2的抑制性信號僅作用於已經識別腫瘤抗原併產生腫瘤特異性反應後的T細胞，即PD-1/PD-L1/2通路介導的是「腫瘤特異性的T細胞選擇性抑制」。應用PD-1免疫檢查點抑製劑後，可以引發腫瘤浸潤性CD8+T細胞的寡克隆擴增，這類細胞可以識別由於腫瘤非同義突變產生的腫瘤新抗原。這一理論已在臨床試驗中得到驗證。在對PD-1單抗有療效的轉移性黑色素瘤患者，接受PD-1單抗治療後，腫瘤組織中PD-1+CD8+ T細胞數目顯著增加，且T細胞數目的增加與患者的療效相關。這類PD-1+CD8+ T細胞均含有寡克隆的T細胞受體表位，對Υ-干擾素介導的信號起作用。這一研究結果也驗證了之前的結論---即PD-1+CD8+ T細胞的功能被PD-1介導的抑制性信號阻斷，應用PD-1抑製劑後，這一阻斷為解除，T細胞功能得以恢復。

PD-1單克隆抗體的研究已經取得很好的臨床治療效果，已有多種藥物批准上市。然而，對於某些癌症，抑制PD-(L)1並不能達到完美療效，需要聯合其他靶點以促進療效。在ASCO 2018會議上一大亮點就是開發PD-1/PD-L1抑製劑聯合治療藥物靶點，下文將對這部分內容進行簡單的總結。

1、OX40

OX40屬於腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族中的一員，又稱為CD134、ACT45、TNFRSF4，是活化的CD4+T、CD8+T 細胞表面的激活性受體。OX40信號可以激活下游的NF-κB、PI3K 和PKB信號通路，而這些信號的持續激活可以延長T細胞的存活時間，擴展T細胞記憶，促進T細胞的細胞殺傷能力。OX40還可以通過抑制調節性T細胞的分化與活性，改善腫瘤微環境中的免疫抑制作用，進而增強效應T細胞的功能。在ASCO 2018的年會摘要中以OX40為靶點的研究有兩篇，雖然沒有和PD-1/PD-L1聯用，但其結果也可以用來評估其聯用潛力。

OX40作用機制（來自EJC）

在2017年Cancer Immunology Research雜誌上的一項研究結果顯示，在小鼠模型中，OX40抗體和PD-1抗體同時給葯，會削弱OX40的效果，導致T細胞凋亡，治療效果比單獨用藥差。但是在同年的另一項研究中發現，先給小鼠用OX40抗體葯，再用PD-1抑製劑，治療效果比先使用PD-1抑製劑的藥效顯著改善。也許在聯合用藥過程中，給葯先後的時機對其療效影響重要。在使用一種免疫療法時可能會對患者的腫瘤微環境和T細胞信號產生影響，如果再加入一種免疫療法時，所起的作用可能與預期的不同。

2、NK細胞免疫檢查點抑製劑

眾所周知，人體的免疫系統由兩大部分組成：先天性免疫系統和獲得性免疫系統。在腫瘤免疫療法中關注度最高的T細胞就屬於獲得性免疫系統的重要組成部分，既有細胞殺傷作用，又可以對抗原產生記憶。而在先天免疫體統中，研究最多的是同樣具體強大腫瘤殺傷能力的NK細胞。正常生理狀態下，NK細胞與T細胞一樣，處於「靜息」狀態。KIR是NK細胞表面的一類可以調節NK細胞活性的受體，其中KIR2DL1/2/3和KIR3DL1/2/3屬於抑制性受體。腫瘤細胞可以利用這一抑制機制，使HLA與這些抑制受體結合，抑制NK細胞對其識別和殺傷。

在ASCO 2018摘要中，法國研究人員對84位經過PD-1抗體、PD-L1抗體、CTLA-4抗體或KIR抗體治療的R/M SCCHN 患者，後續進行化療，結果顯示與單用化療藥物相比，治療效果有所提高。

NK細胞受體免疫機制（來自STREAM）

3、IL-2或CD122

白介素-2（IL-2）是一種常見的細胞生長因子，在機體免疫系統中起著重要作用，主要負責調節白細胞的免疫活性。IL-2與受體結合後可以刺激CD8+T細胞、NK（、細胞和調節性 T 細胞的增殖。IL-2受體（IL-2R）由α、β、γ三條鏈組成，主要表達於T細胞表面，通過誘導 T細胞活化來調節機體的免疫能力。IL-2雖然能夠激活殺傷性細胞的增殖，但是也會刺激調節T細胞（Tregs）增殖。Tregs具有免疫抑制作用，為了能夠做到只激活殺傷性免疫細胞，研究人員開發了CD122激動劑（由β亞單位組成）。

IL-2與不同的受體

CD122主要表達於CD8+ T細胞和NK細胞表面，由β、γ兩個亞單位組成)，而Treg細胞表面同時具有IL-2R的α、β、γ三個亞單位，因此其結構不能與CD122激動劑結合。也就是說CD122偏向激動劑可以選擇性激活對腫瘤細胞有殺傷性的T細胞和NK細胞。在ASCO 2018年會共有三篇摘要與CD122激動劑與PD-1/PD-L1抑製劑聯合用藥有關，結果顯示聯合療法可以對抗黑色素瘤、腎細胞癌、非小細胞肺癌、胰腺癌等，顯著提高患者的客觀緩解率。

4、CCR4

CCR4作為趨化因子受體家族的一員，是CCL2、CCL4、CCL5、CCL17和CCL22等因子的受體。CCR4主要表達於兩類細胞：一是過表達於外周T細胞淋巴瘤細胞（CTCL）；二是表達於正常的Th2細胞、調節性T細胞和NK細胞。CCR4與相應配體結合可以調節調節性T細胞和NK細胞等免疫細胞的功能，過表達於CTCL細胞表面的CCR4可以作為特異性治療靶點，實現對腫瘤細胞的靶向殺傷。在此次ASCO涉及CCR4的報告不多，但與PD-1/PD-L1聯合療法有五項。

CCR4作為T細胞免疫治療的靶點（來自Blood Journal）

5、CXCR4

CXCR4是趨化因子受體-4，屬於G蛋白偶聯受體超家族，具有趨化免疫細胞、維持免疫細胞動態平衡的生物學功能，在多種癌症細胞中表達，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌和多發性骨髓瘤中。在ASCO摘要中，有六篇摘要與CXCR4相關，在腫瘤治療過程中使用了五種CXCR4拮抗劑，並取得良好的治療效果。已經有多篇文獻報道了CXCR4拮抗劑與PD-1抑製劑聯合免疫療法的治療效果。

CXCR4相關信號通路（來自PLOS）

6、CD73

CD73是NT5E基因編碼的胞外-5-核苷酸酶，將細胞外AMP轉化為腺苷的關鍵酶。CD73在多種腫瘤細胞過表達，不僅抑制免疫細胞功能，還可直接刺激腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，以及腫瘤血管生成。在本次ASCO的五篇CD73相關的研究中，證實了CD73的高表達量與癌症發展的關係，以及CD73在癌症免疫治療中的重要作用。聯合PD-1抑製劑免疫療法，可以產生更多效應細胞。

CD73胞外機制（來自CellPress）

7、GITR

GITR是腫瘤壞死因子受體超家族中的一員，在調節性T細胞中表達量最高，在效應T細胞中也有表達。尤其是當Teff細胞被激活後，GITR表達量會在短時間內快速升高。激活Teff細胞表面的GITR，可以促進Teff細胞的增殖和存活。而Teff細胞作為消滅腫瘤細胞的「主力軍」，在其數量和活性提升後，可以提高免疫治療的效果。。同時，當抗體和 Treg 表面的 GITR 結合後，GITR 通路可以促使 Treg 細胞衰竭。Treg 作為具有抑制 Teff 功能的細胞，誘發其衰竭可以間接的起到激活 Teff 功能的效果。所以針對 GITR 的抗體會有」一箭雙鵰」的雙重功效，能全面武裝免疫系統去攻擊腫瘤細胞。

GITR作為免疫治療靶點在T細胞中的作用模式（來自EJC）

8、LAG-3

LAG-3也被稱為CD223，屬於免疫球蛋白超家族，在激活的NK細胞、T細胞等免疫細胞表面廣泛表達，與CD4有20%的相似度。LAG-3配體之一是主要組織相容性複合體（MHC）Ⅱ類分子，親和力強於CD4。腫瘤細胞通過自身表達MHCⅡ類分子結合併激活免疫細胞表面的LAG-3，逃避免疫抑制。膜表面的LAG-3具有免疫抑制作用，但可溶性LAG-3卻是抗原遞呈細胞的激活劑，可以激活DC細胞、CD8+T細胞，增進免疫反應。在ASCO 2018的摘要中，LAG-3抗體與PD-1單抗聯合治療晚期癌症。

LAG-3作用機制（來自Immunology）

腫瘤免疫療法已經連續幾年成為ASCO關注的「重頭戲」。作為免疫療法的核心成員，PD-1/PD-L1成為了炙手可熱的靶點，已經上市的PD-1/PD-L1抑製劑藥物每年都會有幾十億美金的利潤，與之相關的臨床研究也有幾千例。在今年的ASCO會議上，和腫瘤免疫檢查點抑製劑聯合用藥的臨床試驗更是備受矚目，如上所列靶點僅僅是一部分。

參考文獻：

1. ASCO 2018

2. Lieping Chen, Xue Han. Anti–PD-1/PD-L1 therapy of human cancer:past, present, and future. J Clin Invest. 2015; 125(9): 3384-3391.

3. Alsaab HO et al. PD-1 and PD-L1 Checkpoint Signaling Inhibition for Cancer Immunotherapy: Mechanism, Combinations, and Clinical Outcome. Front Pharmacol. 2017; 8: 1-15.

4. Gong et al. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 2018; 6: 1-18.

5. AH. Sharpe, KE. Pauken, The diverse functions of the PD1 inhibitory pathway. Nat Rev Immunol. 2018; 18(3):153-167.

6. Sun C, Mezzadra R, Schumacher TN. Regulation and Function of the PD-L1 Checkpoint. Immunity. 2018; 48(3):434-452.

7. Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2012;12(4):252-64.

8. SandrineAspeslagh, et al. Rationale for anti-OX40 cancer immunotherapy. European Journal of Cancer. 2016; 52: 50-66.

9. Ryan A. Wilcox. Mogamulizumab: 2 birds, 1 stone. Blood 2015 125:1847-1848.

10. OHayre M, et al. Elucidating the CXCL12/CXCR4 signaling network in chronic lymphocytic leukemia through phosphoproteomics analysis. PLoS One. 2010; 5(7):e11716.

11. Antonioli L, et al. Anti-CD73 in cancer immunotherapy: awakening new opportunities. Trends Cancer. 2016;2(2):95-109.

12. Knee DA, Hewes B, Brogdon JL. Rationale for anti-GITR cancer immunotherapy. Eur J Cancer. 2016;67:1-10.

13. Nguyen LT, Ohashi PS. Clinical blockade of PD1 and LAG3--potential mechanisms of action. Nat Rev Immunol. 2015; 15(1):45-56.