分光光度法測核酸濃度
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分光光度法測核酸濃度
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來自專欄荷魯斯
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簡介：
每種化學物質都可以吸收、透射或反射一定波長的光。其濃度可以反應為光譜改變的強度。而分光光度計就是用於測量光透過樣品後被吸收特定波長光的光子量。
原理：
根據光源的波長長度，可以將分光光度計分類為紫外-可見光分光光度計和紅外分光光度計。
紫外-可見光分光光度計：紫外光波段（185~400 nm），可見光波段（400-700 nm）紅外分光光度計：紅外光波段（700~1,5000 nm）
分光光度計機器結構
Fig1：分光光度計基本結構（by Heesung Shim）
詳細原理：
光源產生光，瞄準儀（濾鏡）將光聚集透過單色儀（稜鏡），分成幾個分量的波長（光譜），然後通過波長選擇器（狹縫），傳輸所需要的波長。特定波長I0的光透過樣品後，會被吸收一部分，變成It。光度計則檢測It光子量，通過計算，將信號發送到數字顯示器。
不同的化合物有不同的最佳吸光度。例如對硝基酚（酸形式）在320 nm處有最佳吸光值，硝基苯酚鹽（鹼形式）在400 nm處有最佳吸光值。
Fig2: 對硝基酚和硝基苯酚鹽的光吸收值。
Fig2: 對硝基酚和硝基苯酚鹽的光吸收值。
計算公式
光透過比色皿和樣品時，有一部分光被吸收，而光的吸收量與樣品濃度呈線性關係。通過對I0和It的測量，並用比爾-蘭伯特定律(Beer-Lambert law)進行計算，可計算出樣品的濃度。
Fig3: 光透射示意圖。（by Heesung Shim）
光吸收值：
比爾-蘭伯特定律：
- A:測量的光吸收值。又稱光密度「OD」值。
- ε：摩爾吸光係數。
- l:光在樣品中走過的路徑長度。
- c: 樣品濃度。
各個參數及其含義：
- 核酸中的嘌呤和嘧啶鹼具有共軛雙鍵，在240~290 nm紫外處具有強烈的吸收值。在260 nm處具有吸收峰值，230 nm處具有吸收低谷。
- 蛋白質因其有芳香氨基酸，在280 nm處具有吸收峰值。
- 鹽和小分子的吸收峰值集中在230 nm處。
純度分析：
高純度：
- DNA：A260/A280 1.8~1.9; A260/A230 >2.0
- RNA：A260/A280 1.9~2.0; A260/A230 >2.0
- RNA的A260/280比值要比DNA的值高一些，這是因為鹼基U的A260/280的比值要比鹼基T的A260/280比值更高。
異常：
- A260/A280>1.9：RNA可能未除盡
- A260/A280<1.8: 含有酚或蛋白質
- A260/A230<2.0: 有殘存鹽或小分子污染
注意事項：
- 紫外分光光度法不能很好區分DNA和RNA之間的相互污染，需用電泳進行鑒定。
- 若A260/A280=1.8，也可能是蛋白質和RNA同時污染，可通過電泳鑒定RNA，或對圖形分析，看A280 nm吸收光值高低來判斷蛋白質污染。
- A260/A280的值會受到樣品PH和離子濃度的影響。為了確保準確測量，請使用與懸浮或洗脫樣品時相同的緩衝液。
- 樣品濃度過低或過高都可能影響準確性。
- 注意操作時，樣品要混合均勻，不要有氣泡。
參考文獻:
- "Spectrophotometry". LibreTexts
- "Nanodrop經驗談". 於浩然. 科學網博客
- "260/280 260/230". 湯強. 科學網博客
- "OD值和吸光度值". Zmj0630. 丁香園D值和吸光度值". Zmj0630. 丁香園分光光度法測核酸濃度
香園
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