從RNA提取到qPCR-定量數據有效性分析及常見問題解決策略

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熒光定量數據有效性分析

判斷數據的有效性，可以結合擴增曲線，溶解曲線，標準曲線以及NTC（檢驗引物）和NRC（檢驗模板）來分析。

擴增曲線應呈現出平滑的S型曲線，起始無擴增，起峰時間正常，由擴增曲線得到的Ct值是判斷實驗成功與否的重要參考，Ct值有一定的可信範圍，臨床檢驗小於33，科學研究小於38，內參基因一般小於20，且樣品間內參的Ct值差不超過1，表明內參基因表達量穩定，復孔Ct值標準偏差不超過0.5；

溶解曲線應呈現單峰，峰的寬度較小，NTC和NRC無特異的峰出現；

標準曲線的斜率範圍-3.58~-3.10，對應引物的擴增效率範圍90%~110%，R2代表線性擬合度，一般大於0.95；

NTC用於判斷反應是否存在模板污染，引物是否特異，是否會形成引物二聚體。NTC最佳狀況是沒有擴增，即擴增曲線和溶解曲線與基線重合，沒有Ct值。NTC有擴增的情況下，至少與加入模板體系的Ct值相差5或10以上；

NRC用於判斷cDNA模板中是否存在基因組DNA殘留，可以間接反映RNA中基因組DNA污染情況，理想情況下，NRC沒有Ct值，有Ct值的話至少要跟加入cDNA模板體系的Ct值相差5或10以上。熒光定量標準數據參考範圍見下表格：

熒光定量常見問題解析

下面，我們對qPCR實驗中常見問題進行分析：

1、Ct值出現過晚（＞38）：

a. 擴增效率低，反應條件不夠優化，可以重新設計引物或探針、更換靈敏度更高的試劑、改用三步法反應，降低退火溫度；

b. 反應成分降解或模板量偏低，可以設置陽性對照、檢查RNA質量、提高反轉錄效率、採用一步法qRT-PCR；

c. PCR產物太長，可以重新設計引物，擴增長度建議100-200 bp。

2、無Ct值或無信號：

a. 循環數偏少，建議擴增循環數35以上，可以根據具體情況增加循環數至45；

b. 信號採集設置有誤，三步法建議在72℃延伸採集，確定設置了採集信號指令；

c. 引物或探針失效，建議設置陽性對照、探針退火溫度偏低，凝膠電泳檢測是否存在擴增產物；

d. 模板不足或降解，建議檢測RNA質量、提高反轉錄效率、避免cDNA反覆凍融、使用探針法；

e. 閾值設置不正確，閾值建議在指數期進行手動調整。

3、擴增曲線S型異常（圖一）：

a. ROX添加不當，建議根據機型選擇合適的ROX；

b. 模板濃度過高，可以適當稀釋模板，減少擴增抑制；

c. 基線設置不正確，基線期起始於3-10個循環，終止於指數擴增前，有些機型可以手動調整。

圖一

4、擴增曲線平台期不平滑（圖二）：

a. 探針或熒光染料品質不好；

b. 儀器使用過度，熒光收集不穩定；

c. 儀器未經過校正（包括自動校正或ROX校正)；

d. 體系中抑制物較多，導致熒光不穩定。

圖二

模板中抑制物包括多糖類，有機溶劑，蛋白酶K等，可以參考之前給大家介紹的RNA品質檢測內容。一般cDNA中存在抑制物可以在反轉錄前對RNA進行梯度稀釋，分別進行反轉錄，可以減少或消除抑制物的影響（參見圖三）。

圖三

5擴增精密度差（圖四）：

a. 加樣誤差，建議引物和qPCR Mix先預混，分裝後加模板；

b. 體系配置錯誤，仔細檢查操作步驟；

c. 反應液沒有混勻，充分渦旋混勻；

d. 低拷貝基因或模板濃度過高或過低，調整模板上樣量，cDNA原液加入體積不超過體系總體積1/10；

e. 未引入校正系統，根據機器型號加入ROX。

6、溶解曲線不是單峰（圖五）：

a. 引物設計及用量問題，建議重新設計退火溫度較高（58~62℃），無錯配，Blast比對特異的引物、引物用量合適（0.2~0.4 μM）；

b. 模板有基因組污染，建議優化RNA提取方法，選擇合適的反轉錄試劑，跨內含子設計引物；

c. 基因表達量低，建議增加反轉錄效率，適當提高模板量，選用一步法qRT-PCR；

d. 擴增體系不佳，可以使用靈敏度高，特異性強，封閉技術先進的試劑。

7、標準曲線線性關係不佳（圖六）：

a. 加樣誤差，建議標準品加樣體積大於2微升、引物預混後再分復孔，定期校正移液器，盡量選擇硅化槍頭，使用文庫稀釋液稀釋標準品，降低耗材管壁對DNA吸附；

b. 標準品降解，應該避免反覆凍融、電泳檢測發現降解後重新製備稀釋標準品；

c. 模板濃度高或有抑制物，可以改變稀釋精度，增加稀釋梯度；

d. 引物或探針不佳，重新設計引物和探針；

e. PCR酶靈敏度不高及活力下降，建議更換靈敏度更高，線性關係更好的試劑，校正-20℃冰箱，使用時將酶置於冰上。

8、NTC有擴增：

a. 水，試劑或引物污染，可以分裝水和引物，試劑優先於引物和模板加入到體系中；

b. 引物二聚體，建議優化引物設計，提高退火溫度（58~62℃），降低引物濃度（0.2~0.4 μM）；

c. PCR核心酶特異性差，可以選用封閉技術先進（全封閉）的試劑。

9、擴增效率低：

a. 反應條件不夠優化，建議降低退火溫度，使用三步法，使用擴增更線性的試劑；

b. PCR抑制物，建議優化核酸純化方法，適當稀釋模板降低抑制物影響；

c. 引物設計，引物避免3』端錯配、擴增片段長度在100~200 bp 。

文章作者：全式金技術部鄭恆