清華大學劉萬里課題組在《Science》發文報道自身免疫疾病相關的調控B淋巴細胞活化和分化的新機制

2018年10月4日，清華大學劉萬里課題組在《科學》（Science）雜誌發表題為《自身免疫病相關IgG1變異體調控B細胞活化及分化》（An autoimmune disease variant of IgG1 modulates B-cell activation and differentiation）的研究論文（First Release in an online article; the article will appear at a later date in print）。該論文首次報道人類膜聯免疫球蛋白IgG1重鏈胞內區存在增加系統性紅斑狼瘡（SLE）易感性的單核苷酸多態性位點（SNP），並揭示該SNP參與調控B細胞命運決定的新機制，為研究系統性紅斑狼瘡等自身免疫疾病的致病機制和精準診療提供新的潛在靶點和理論支持。

SLE是最常見的自身免疫疾病之一，是一種由遺傳、環境、免疫等多種因素導致的複雜性疾病，以產生多種自身抗體、免疫複合物沉積並累及多器官（皮膚、腎臟、肺臟、心臟和腦）為臨床表現，造成一系列併發症，嚴重時可導致死亡。其發病機制至今尚不清楚，導致治療手段有限且無法根治。因此探究SLE的發病機制一直是基礎免疫學和風濕免疫病學關注的重點和難點。

B淋巴細胞是抗體免疫應答的核心效應細胞。在生理條件下，其通過分泌防護性抗體來清除入侵機體的病原體，從而保護人體的健康，並且留給人體記憶性免疫力，這也是B細胞通過疫苗免疫發揮防護效應的重要基礎。然而，在病理條件下，具有自身反應性的B細胞在被異常激活後能夠分泌識別自身抗原的抗體，這些自身抗體進而對自身組織進行攻擊並引起抗體介導的免疫反應，並累及多個器官，對機體造成損害。具有自身反應性的IgG型記憶性B細胞在人體中廣泛存在，而且SLE等自身免疫疾病常伴隨大量自身抗體的產生。

基於上述兩點事實，劉萬里課題組提出IgG型B細胞受體（IgG-BCR）的異常活化可能參與到SLE等自身免疫病的發病過程中這一猜想。通過與北京大學人民醫院牽頭、北京大學深圳醫院和北京大學第一醫院參與的北大醫學風濕免疫病學專業的合作研究，劉萬里團隊和栗占國團隊共同發現人類膜聯免疫球蛋白IgG1重鏈基因IGHG1上的SNP（rs117518546）在SLE患者中顯著增加，該SNP導致人類膜聯免疫球蛋白IgG1第396位甘氨酸突變為精氨酸（IgG1-G396R）。進一步的臨床指標相關性分析表明，攜帶該SNP的SLE患者產生更多更廣泛的IgG1型的自身抗體，發生炎症反應的風險增加，疾病活動指數也更高，揭示該SNP為新的SLE易感基因位點。有趣的是，劉萬里團隊通過分析千人基因組測序數據，發現該SNP主要在東亞人群中的攜帶頻率（minor allele frequency，MAF）較高，而在歐美人群中極少，這提示該SNP是以漢族為代表的東亞人群特有的SLE易感基因位點，可能是我國SLE患者與其他人群患者的臨床表現和治療反應存在差異的因素之一。

劉萬里團隊進一步利用該SNP的基因敲入小鼠，發現在自身免疫誘導模型中，攜帶該SNP的小鼠產生更多、更廣泛的自身抗體，而這依賴於B細胞受抗原刺激後大量自身反應性漿細胞的分化，從而驗證了在SLE患者中的發現，並從B細胞命運決定層面給出了初步解釋。與此同時，鑒於該SNP在東亞人種中的攜帶頻率較高，且IgG型記憶性B細胞的產生和功能在疫苗免疫中發揮著重要作用，劉萬里團隊探索了該SNP對正常疫苗接種激發的抗體應答的影響。季節性流感疫苗免疫的健康志願者隊列研究揭示，該SNP的純合型攜帶者的流感病毒特異性IgG1抗體應答顯著高於未攜帶該SNP的健康志願者。這一結果表明，該SNP對調控IgG型B細胞介導的抗體應答的具有典型的「雙刃劍」效應：一方面促進機體中能識別非我抗原的防護性抗體的產生，幫助機體抵禦病原體入侵；另一方面在免疫系統異常的情況下，促進識別機體自我抗原的記憶性B細胞產生自身抗體，加劇SLE的發生和發展。

在分子機理層面的研究中，劉萬里團隊發揮其實驗室多年來的研究特色，整合基於全內反射熒光顯微鏡的高速高解析度活細胞單分子成像平台和基於Matlab的單分子軌跡追蹤演算法，揭示該SNP顯著延長IgG-BCR活化後招募的下游信號分子Grb2在B細胞免疫突觸中的駐留時間。常規生化分析揭示這種增強的駐留特性，並非因為Grb2與SNP突變位點所在的磷酸化IgG-BCR胞內區免疫受體尾部酪氨酸基序（ITT-motif，以下簡稱ITT基序）的結合力增強。更進一步的基於激酶-底物互作的分子動力學模擬，揭示該SNP突變通過形成新的激酶-底物間的氨基酸殘基相互作用（激酶290位天冬醯胺與底物390位精氨酸形成氫鍵），顯著增強了Lyn激酶結構域與ITT基序的結合，進而極大的促進了Lyn對ITT基序的磷酸化效率，使得變異體的B細胞免疫突觸中的磷酸化ITT基序的密度顯著增加，從而改變Grb2在免疫突觸中的招募模式，從招募-逃逸（Recruit and Escape）,轉換為招募-限制（Recruit and Confine）, 這毫無疑問延長了Grb2在免疫突觸中的停留時間，更有效促進Grb2-BTK-PLCγ2信號小體在免疫突觸中的形成，極大的增強了包括NF-κB、Erk等在內的下游信號通路的免疫活化，上調Blimp1和Irf4等轉錄因子的表達，促進B細胞免疫活化後向分泌抗體的漿細胞分化的命運決定。

本論文從疾病易感基因位點的臨床遺傳學研究出發，開展大樣本多中心臨床相關性分析，再到基於基因修飾小鼠的動物模型研究，和基於新型成像技術和常規生化分析的受體活化信號通路解析，最後到基於分子動力學模擬的蛋白互作面的三維結構研究。這一系列的研究結果加深了人們對SLE易感基因位點功能及致病機理的認識，為SLE研究提供了全新的研究靶點，也為複雜疾病相關易感基因位點的研究提供了創新性的研究模式。值得一提的是，該研究發現了在以漢族人為代表的東亞人群中廣泛存在，但在歐美人種中極少存在的SLE易感SNP，為在中國罹患SLE的近百萬患者，提供精準醫療的潛在靶點和理論支持，具有重大的潛在的社會意義和經濟價值，是書寫在祖國大地上的研究成果。

清華大學生命學院2018年1月份已畢業的陳相軍博士為論文第一作者，生命中心PI劉萬里研究員為論文的通訊作者，北京大學人民醫院風濕免疫科栗占國教授為論文的共同通訊作者。北京大學人民醫院風濕免疫科孫曉麟副研究員，清華大學生命學院PTN項目博士生楊為和清華大學生命學院博士生楊冰等為本論文研究做出重要貢獻。本研究需要大力整合臨床免疫學、基礎免疫學、分子細胞生物學、生物物理學和計算生物學等不同學科的交叉優勢，在研究過程中得到了北京大學定量生物學中心來魯華教授，北京大學第一醫院張宏教授，北京大學深圳醫院王慶文教授，清華大學醫學院和免疫所祁海教授，中科院上海生化細胞所許琛琦研究員，中科院生物物理所婁繼忠研究員，中科院微生物所張福萍研究員，北京協和醫院鄭文潔教授，華中科技大學同濟醫學院鄭芳教授，南京醫科大學胡志斌教授等國內外同行的大力支持。該研究得到了清華大學實驗動物中心、生物醫學測試中心的支持。該研究由國家自然科學基金委、科技部、青年千人計劃、清華大學免疫學研究所、清華-北大生命科學聯合中心、北京市科委和深圳市三名工程提供經費支持。

  劉萬里課題組一直致力於使用新型的高速高解析度的活細胞單分子熒光成像技術，結合傳統的分子免疫學、生物化學和生物物理學研究手段，對B淋巴細胞免疫識別、免疫活化及相關免疫疾病的致病機理進行研究。回國獨立工作以來，以通訊作者（含共同）發表多篇論文：Cell、Leukemia、Science Immunology、J Exp Med、PNAS、eLife（2015和2017）、J Cell Biol、Nature Communications（2015和2017）、Science Signaling、Cell Research（2014和2018）、Cell Reports、J Immunol（2013、2014和2017）、Eur J Immunol.、Frontiers in Immunology、Trends ln Immunology等。該論文的發表是劉萬里課題組對該領域的新貢獻。據不完全統計，該論文也是國內科學家在B細胞免疫識別、免疫活化和免疫調控領域，在風濕免疫病研究領域，首次在《科學》（Science）雜誌發表研究論文。

圖1. SLE易感基因突變IgG1-G396R改變Grb2在B細胞免疫突觸中的招募方式

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