藥理學博士生：並非給馬兜鈴酸洗白，我只談研究的3個邏輯漏洞

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作者：北京協和醫學院藥物植物研究所 2014級直博生 侯睿

前幾天發表於Science子刊Sci Transl Med關於馬兜鈴酸和肝癌發生相關的文章在圈內引起不小的轟動，文章的主要結論認為馬兜鈴酸是台灣和大陸肝癌的最為潛在的誘導因素。一時間，這個研究結果被各大醫學媒體競相報道和轉載，對於馬兜鈴酸這個詞也是談之色變。對於面向公眾的各個媒體，特別是自媒體，以科普的形式向公眾介紹這篇論文的研究成果本沒有任何問題，然而，對於藥理學專業的我而言，認識這篇文章的研究成果卻不能僅僅停留在這個層面上。仔細挖掘文章內容之後，我在這篇文章的行文思路中發現了一些值得拿來討論的邏輯漏洞，這些問題如果不得到合理解釋，那麼馬兜鈴酸誘導肝癌的說法是否完全正確，還有待商榷。

當然，這僅僅是從邏輯上質疑這篇文章得出結論的方式，並非去否認馬兜鈴酸的致癌作用或者毒性，畢竟馬兜鈴酸的毒性和致癌性或者其腎損傷作用，早就是業界公認的了。

馬兜鈴酸誘導的特徵基因突變是研究團隊自己定義的

文章的最主要結論可以歸納為兩條：①馬兜鈴酸能夠引起基因突變的特徵是確定的；②通過對肝癌樣本的全基因組測序分析，發現台灣98例肝癌患者的病理樣本中，有78％具有馬兜鈴酸誘導基因突變的特徵，大陸89例肝癌樣本中，有47％具有相關特徵，而日韓以及歐美這方面的比例就相對較低。

然而需要注意的是，馬兜鈴酸誘導基因突變的特徵表現，在文章中被定義為高比例的A:T＞T:A突變（此研究團隊對於這種突變的表述有兩種，包括A:T > T:A mutations，以及A:T to T:A transversions，在此均使用這一種表述方法），這個特徵表現是該團隊在既往研究中，通過測序馬兜鈴酸處理的體外培養細胞得來的。

那麼一一對應的，有兩個問題就不得不提出來。

1.文章的試驗方法（Method）部分，關於患者對於馬兜鈴酸的暴露是如何界定的，多長時間，服用多大劑量，這篇文章完全沒有提及。在Method中有一句話講的是，這個試驗是一個回顧性的試驗，因為在試驗開始之前，沒人知道這些肝細胞癌的患者到底有沒有表現出馬兜鈴酸致突變的特徵。而文章的結果（Results）部分的行文邏輯就是，檢測出高比例的A:T＞T:A突變，即認為是馬兜鈴酸致突變的結果（文章中表述為AA mutational signature）。換句話說，這篇文章是建立在他們團隊已有研究基礎上的，即暗含的一個邏輯就是：腫瘤組織中高比例的A:T＞T:A突變必然是馬兜鈴酸暴露的結果。

2.關於馬兜鈴酸誘導基因突變的特徵表現，此篇研究並沒有進行證明，而是引用的相關文獻。然而，提供這個結論的3篇參考文獻，全部是該團隊的研究成果，包括Sci Transl Med. 2013 Aug 7;5(197):197ra101.， Sci Transl Med. 2013 Aug 7;5(197):197ra102. ，Genome Med. 2015 Apr 28;7(1):38. 。下面我們一個一個來看。

得出「馬兜鈴酸導致特徵基因突變」結論的參考文獻說了點啥？

Sci Transl Med. 2013 Aug 7;5(197):197ra101.

這篇文章用馬兜鈴酸刺激HK2細胞HK2（人腎近曲小管上皮細胞)並且測序，發現了明顯的A:T到T:A的基因突變，而此模型為慢性模型，HK2細胞用濃度10 μM（按照文章說法為亞毒性非致死劑量）的馬兜鈴酸處理了6個月。而體內試驗卻只利用C57小鼠做了50 mg/kg的腎急性毒性試驗，至於在體內模型上有沒有馬兜鈴酸導致的突變特徵，這篇文章沒有提及。

Sci Transl Med. 2013 Aug 7;5(197):197ra102.

這篇文章講的是19例曾暴露於馬兜鈴酸的患者，其尿路上皮癌的測序表明，72％的突變為A:T到T:A的基因突變，即馬兜鈴酸致突變的特徵。

Genome Med. 2015 Apr 28;7(1):38.

這項研究對於2例確定攝入馬兜鈴酸的膀胱癌患者病理組織進行測序，發現了明顯的A:T到T:A的基因突變，並在此基礎上擴大了樣本研究。

這3篇關於馬兜鈴酸突變特徵的引文，僅第一篇用一個體外試驗進行了特徵研究，其餘兩篇的結論都是建立在第一篇特徵研究結果之上，與此次肝癌的研究類似。

且不說基於同樣結論的研究，居然發了好幾篇這種相關文章，換個癌症樣本又發了一篇，有灌水的嫌疑，這裡有3個重大邏輯問題需要搞清楚。

問題一：所有高比例A:T＞T:A突變都要馬兜鈴酸背鍋嗎？

這篇關於馬兜鈴酸致肝癌的研究的最大問題在於，是不是所有高比例的A:T＞T:A突變都可以認為是馬兜鈴酸造成的。首先，作者自身承認此研究為回顧性研究，而文章的表現出的邏輯是，凡是檢測到這種特徵基因突變的情況都認為是馬兜鈴酸致癌症基因突變的特徵。在這種情況下，需要排除的是：

1、是不是只有馬兜鈴酸致基因突變才有高比例的A:T＞T:A突變的特徵，而其他致突變物質或因素均無此特徵，如果不是，則具有此特徵的突變不能認為均由馬兜鈴酸導致。特別是臨床研究中，患者取樣前的生活習慣以及所受的影響均無法控制，因此不能排除在此研究中高概率、高比例的A:T＞T:A突變的特徵，是拜其他致突變因素所賜。這個問題，此研究所引用的文獻並沒有回答。

2、在亞洲，包括台灣和中國大陸的肝細胞癌患者中，高比例的A:T＞T:A突變的特徵遠高於歐美，是否與人種不同相關。即同樣是肝細胞癌，亞洲人本身就是高比例的A:T＞T:A突變而歐洲人不是這樣。類似的影響因素還包括飲食結構不同、乙肝的廣泛傳播等，這些因素此項研究並沒有排除。

問題二：拋開劑量談突變也是耍流氓

即使有人說，馬兜鈴酸這種誘導突變的物質沒有絕對的安全劑量，但是對於基因突變，人體自身是有一套自我修復機制的，因此想要引起能夠誘發癌症的突變，仍然需要攝入一定劑量持續一定時間才能導致。

1.多大劑量的馬兜鈴酸攝入多長時間能夠導致這種突變特徵？這是高比例的A:T＞T:A突變作為馬兜鈴酸致突變特徵的條件問題。在相關參考文獻中，僅僅是將HK2細胞在10 μM濃度的馬兜鈴酸里連續培養了6個月之後進行測序。這樣的造模方法，到底相當於每天攝入多少馬兜鈴酸？連續攝入多長時間？該團隊的一系列文章均沒有涉及。

2.更大的漏洞在於，在這個研究中，連動物的長期毒性試驗都沒有做，僅僅做了急性毒性，而對於急性毒性的試驗，僅僅報道了毒性作用，卻沒有涉及致突變作用。這些數據的缺失讓人不得不懷疑，在馬兜鈴酸的長期毒性試驗中，或許動物還沒來得及發生能夠誘導癌症的突變，就已經被馬兜鈴酸的腎毒性毒死。那麼同樣的情況，在肝癌患者中，到底有多少人能夠不受腎毒性的影響，而攝入足夠劑量的馬兜鈴酸，以至於能夠導致肝癌。還是同樣的問題，是不是所有高比例的A:T＞T:A突變均可以認為是馬兜鈴酸造成的，要下結論恐怕為時尚早。

問題三：馬兜鈴酸高攝入地區的肝癌發病率到底高不高？

對於台灣地區和中國大陸，馬兜鈴酸誘導突變致肝癌的特徵明顯高於日韓以及歐美這個問題而言，其潛在的台詞是，這些地區存在廣泛的馬兜鈴酸暴露，即馬兜鈴酸的過量攝入。那麼，如果一個地區存在對某種癌症的特殊潛在威脅，該地區此種癌症的發病率應該「水漲船高」。而此項研究根本就沒有提到中國大陸、台灣地區，以及日韓、歐洲、美國等地區肝癌的總體發病率，而只講到了具有高比例A:T＞T:A突變特徵的肝癌比例，這種統計方式的意義也有待商榷。

此外，還有一個問題需要納入討論，即樣樣本的取樣方式。這篇關於肝癌的研究對於台灣地區肝癌組織的98例取樣，僅僅從兩家醫院獲得，這樣的取樣方式是否真正具有代表意義，也是有待商榷的。

綜上，對於馬兜鈴酸造成A:T＞T:A突變的結論，筆者個人傾向於認為是正推可以、反推不行，即馬兜鈴酸可以造成癌組織高比例A:T＞T:A突變，而並非所有具有此特徵的突變均由馬兜鈴酸造成。直接將具有這類特徵突變的肝癌均認為是馬兜鈴酸暴露導致，這個結論顯然下得為時尚早。

對於馬兜鈴酸，仍需要擺正態度

然而，以上僅為對於這項研究結論方式的質疑，至於如何看待馬兜鈴酸，仍需要擺正態度。

1.這篇文章存在邏輯漏洞，並不代表馬兜鈴酸的毒性和致癌作用就不存在。

2.馬兜鈴酸的致癌性是一個值得注意的問題，雖然這篇文章的結論方式有待商榷，但是這種研究結果的傳播，有利於公眾對於馬兜鈴酸暴露潛在傷害的關注，該研究結果仍有一定參考價值，只是應當客觀對待，不要盲目過度解讀。

3.對於Sci Transl Med來說，刊登這樣的文章也沒有任何問題，雖然其可能存在邏輯漏洞。科研論文存在不能自圓其說的情況，甚至得出錯誤結論的情況是正常的。對於這種可能與重大健康安全問題相關的研究，科學期刊也有刊登的必要，以引起廣泛重視，即便今後的研究結果完全否定了這篇文章的結論，能夠促使公眾關注並正確認識馬兜鈴酸這種物質，也是這篇文章的貢獻所在。

4.馬兜鈴酸這類物質存在於一些中藥里，這是無可否認的，因此，有必要在將馬兜鈴酸毒性和致突變性作用機理研究透徹的情況下，討論這些中藥的應用問題。以目前的情況，作為具有安全隱患的物質，對含有馬兜鈴酸的中藥採取限制使用的態度是正確的選擇。