細胞電轉染過程中的影響因素

1 電場參數

電場是電轉染的重要因素，細胞在電場的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成轉染過程。因此電場強度是應該被優化的主要參數。電場強度不能過高，過高會增加細胞的死亡率；也不能過低，過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一個適宜的電場強度至關重要。

不同細胞系具有不同的最佳場強值，其確定方法除了實驗直接測定比較不同場強下轉染率的高低外，還可以採取較為簡便的間接法。文獻顯示存活率在50%左右的電場參數為理想參數，故可間接測定存活率來確定最佳場強值。

2脈衝過程

1）脈衝波形

脈衝波形主要分為兩種：1、方波脈衝；2、指數遞減波脈衝。

方波脈衝是指：電壓瞬間升至預設電壓，保持電壓放電，然後瞬間終止放電。

一般哺乳動物細胞電轉染時選擇方波脈衝，有較高的轉染效率和細胞存活率。

指數遞減波脈衝是指：先對電容充電，然後讓電容完全放電，其電壓變化呈指數遞減。一般這種波形的脈衝電轉染適用於細菌、酵母菌、昆蟲細胞。

2）脈衝時間

脈衝時間的選定主要取決與脈衝波形。在方波脈衝中，脈衝時間可直接設定。在指數遞減波脈衝中，脈衝時間是指電壓衰減至初始電壓1/3時所用的時間，等於電容（C）與電阻（R）的乘積，單位是ms。在參數優化中，增加電壓應當降低脈衝時間，而減小電壓則應當增大脈衝時間。

3）脈衝次數

一般而言，對於大多數細胞類型都選擇單次脈衝。而在有些情況下可能會用到多次脈衝，因為低電壓、短脈衝時間、多次脈衝可有效避免細胞損傷。多次脈衝建議中間間隔1min。

3細胞因素

用於電轉的細胞一般選取處於對數生長期的細胞（15代以內，傳代後2d）。因為處於對數生長期的細胞分裂旺盛，表面結構緻密比穩定期的細胞差，電轉後，細胞膜的恢復能力強，而且處於有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA.細胞懸液濃度一般為1*106/ml，當細胞生長密度大於3*106/ml，轉染效率會下降。原因除了細胞老化外，細胞過密會使相鄰細胞相互作用增大，甚至使細胞相互融合，從而導致電場的局部微擾，使電場環境無法均一化，細胞體積越大對電擊越敏感，所需電場強度也越小。

4 質粒因素

從質粒濃度看，細胞密度為1*106/ml，DNA用量在2-5ug/ml轉染效率最高。轉染率在一定一定範圍內隨質粒濃度的上升呈線性增高，但是到達一個峰值後，隨DNA用量增加而轉染率逐漸下降，其原因可能為細胞吸納DNA有一個飽和度，過量便會產生毒性，使存活率降低，不利於轉染率提高。

進行小分子量的分子轉染時（siRNA/miRNA），應使用高電壓、短脈衝時間。大分子量分子轉染時（DNA），應使用低電壓，長脈衝時間。

從質粒的純度看，用高純度的DNA才 能提高電轉的效率，且應注意以下幾點：首先DNA／RNA應該超純(A260／A280>1．8)，其次應不含內毒 素，同時質粒應溶於雙蒸水而不是TE緩衝溶液。

5 溫度

一般情況下，電轉的過程是在室溫下進行，但在 電擊前後可對細胞進行冰浴處理。電擊前冰浴的時間對轉染率影響不大，但低溫環境能夠防止DNA被外源性DNA酶降解，並限制在電擊中因Joule作用而產生的不良反應，因此，實驗一般選擇電擊前冰浴5min。電擊後冰浴，會影響DNA攝入，因為電擊後冰浴可增強細胞收縮，細胞膜上的 電穿孔封閉較慢，延長外源性DNA攝入時間，從而提高其攝入量。在室溫環境下，雖然細胞膜上的孔 封閉速度快，但在隨後2h，質粒還可通過電內化進入細胞，因此攝人量不一定比4℃環境下低。而且，室溫下細胞在5 min內即閉孔，在4℃的環境下穿孔狀態可保持4h，穿孔封閉緩慢降低了存活率，同時細胞在低溫下更容易受到損傷。

因此，綜合考慮攝人量和存活率，大部分文獻傾向於電擊後細胞仍在室溫或37℃下保存。

6電轉染試劑的選擇

電擊會對細胞造成一定程度的傷害，在轉染試劑的選擇上要注意，應選擇具有細胞膜修復成分的電轉染試劑，如engreen的Entranster-E，將電擊對細胞的損傷降到最低。

7電轉後培養液的選擇

細胞在電擊後十分脆弱，其 培養液的選擇應注重提高細胞的存活率，一般選擇 低滲的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可參考 加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO，因為海藻 糖具有穩定DNA、蛋白質以及細胞膜的作用，並提高電轉後細胞特別是淋巴細胞的存活率。此外， 有文獻顯示凋亡是細胞電擊後死亡的主要原因，電 擊後的培養液還可加入Caspase抑製劑和SCFGM-CSF等細胞因子。