顯微鏡能DIY嗎？能，一不小心還能獲個諾貝爾獎

來自專欄 Nature自然科研12 人贊了文章

導語：小部分科學家開始了顯微鏡DIY：如若沒有合適的研究工具，就親自動手造一個。

Wesley Legant在賓夕法尼亞大學讀生物工程博士期間，遇到了一個令他沮喪的問題：儘管有想法，卻沒有能驗證他想法的器材。

秉著對細胞力學和運動性的興趣，Legant嘗試開發能夠測量細胞對其環境所施加作用力的工具。他將帶熒光的珠子嵌入正在生長的哺乳動物細胞周圍的材料中，這樣一來細胞的運動會使材料變形，同時熒光珠子也隨之運動。通過測量珠子的移動，Legand就能夠計算出細胞施加的作用力。儘管如此，他仍難以獲得準確數據。他表示：「這一工具是成功的，但是很快目前可用顯微鏡的局限顯現出來了。」

細胞在其自身作用力下緩慢移動，最快的速度僅為每分鐘幾微米，因此顯微鏡需要長時間記錄這一運動過程。為了追蹤珠子的3D運動，Legant必須在高空間解析度下對整個空間成像。在2010年前後可獲得的商業顯微鏡——點掃描及轉盤共聚焦顯微鏡，都不能勝任這項工作。

Legant表示：「其實這些顯微鏡的解析度都足夠追蹤記錄我們想觀察的運動，但是其光毒性過強且速度太慢。」

如果是一個透明立方體，共聚焦顯微鏡使科學家能夠逐個捕捉立方體中的每個點，並逐步形成3D圖像。為了達成這一點，顯微鏡投射的光束垂直穿過樣品，光線延伸穿過每個點。然而每次光線投射都會產生損傷樣品的活性氧，這便是Legant所提到的光毒性效應。同時，顯微鏡所能檢測的熒光基團的發射光隨時間減弱，這一現象被稱為光漂白。

在Legent的實驗中，每個3D圖像的獲取需要約一分鐘，之後他只能等五分鐘再拍攝下一張照片，好讓細胞利用這段時間恢復，避免在收集到理想數據之前細胞就被殺死。他能夠用這種方法測量細胞施加的作用力，但卻無法達到理想的精細程度。

為了解決這些問題， Legant在博士後研究中轉移了研究重點。他與霍華德·休斯醫學研究所珍妮莉婭·法姆研究學院（Janelia Research Campus）的物理學家及顯微成像專家Eric Betzig合作，加入了正在逐漸壯大的顯微鏡DIY團體。

實時成像

製造顯微鏡是一項複雜且耗時的挑戰，需要一個全能團隊來處理所涉及的光學、機械及計算機方面的一系列問題。不過，潛在回報是巨大的，一種新的顯微鏡不僅能促進生物學發展，也促進顯微鏡學自身的進步。

在珍妮莉婭·法姆研究學院，研究者嘗試突破神經科學和發育生物學的研究界限。這些領域高度依賴顯微鏡和成像技術，因此該機構有大量現成的商業顯微鏡。但當所需顯微鏡不存在時，他們不會等著別人來發明，而是自己在機構內部製造。

「我們進行技術研發工作的動力就是讓利用現存顯微鏡不能進行的新型實驗變成可能。」Philipp Keller表示。他是珍妮莉婭·法姆研究學院一名研究斑馬魚和果蠅神經系統發育的物理學家。

2005年左右，Keller在德國海德堡歐洲分子生物學實驗室也遇到了與Legant類似的難題：他想在斑馬魚發育胚胎中追蹤所有細胞以研究它們如何運動並聚集形成不同的組織和器官。但絕大多數已有的顯微鏡不能對直徑700微米大小的細胞團樣本進行成像，而長時間拍攝同樣會因為高強度的光而導致細胞死亡。

因此，Keller轉向了當時剛開始投入使用的層光顯微技術。層光顯微鏡並不照射整個樣本，而是將弱聚焦、低強度的光層投射到用戶想要拍攝物體的焦平面上。高質量的照相機能夠在一次曝光中捕捉到完整的焦平面，通過沿著樣品垂直移動該平面，研究者就可以重建完整的3D物體。

「層光顯微成像是一種非常快速的技術，但同時也非常溫和，」Keller說，「焦點外的結構不會暴露在光下受到可能的光損害。」那時沒有現成的顯微鏡適用於Keller的研究，因此在2005年，他決定自己製造。他的設計被命名為數字掃描激光層照熒光顯微鏡（DLSM），能夠在90秒內拍攝斑馬魚發育胚胎中的每一個細胞。

並非每個顯微鏡製造者在開始設計時頭腦中都有特定的研究問題。對德國哥廷根馬普生物物理化學研究所的物理學家Stefan Hell而言，提出顯微技術新概念本身就是目標。「這就是一項科研項目，我做這些是為了推動顯微成像技術發展。」

他獲得了巨大的成功。2014年，Hell與斯坦福大學的William Moerner以及Betzig共同被授予諾貝爾化學獎，以表彰他們所發明的超分辨熒光顯微鏡，這項技術使研究者能夠成像納米尺度的生物結構 。

儘管Hell創造了多個顯微鏡設計並使其商業化，但他認為絕大多數生物學家並不需要效仿，因為製造商很快會將新想法轉化為產品。他自己獲得諾貝爾獎的設計——受激發射損耗顯微鏡（STED）——在1999年製造時花費了20萬美元，而現在已經成為鞋盒一半大小的自動化系統並且能夠附加到任何現有的共聚焦熒光顯微鏡上。他表示現在也已經有一些公司在生產層光顯微鏡。

但Keller同時也說層光顯微技術領域目前仍處於初期，少數商業化系統仍比科學研究最前沿設計落後七到八年。「我們仍不得不製造自己的顯微鏡。」

自製顯微鏡有利也有弊。定製顯微鏡系統可能在速度和解析度方面領先多年，並且可能更適用於某特定生物問題或系統，但這是以其靈活性為代價的。對某些DIY顯微鏡而言，即使是改變放大倍數這樣的簡單操作也可能很困難。此外，定製顯微鏡需要花大量時間和精力來組裝和維護。

不過，來自美國國家心肺血液研究所的細胞生物學家Clare Waterman表示，對於那些願意接受挑戰的人而言，這樣做是值得的。在上世紀90年代初，Waterman利用新拍照技術開發了熒光散斑顯微技術，這項技術使得針對細胞骨架及其他大蛋白複合體的研究成為可能。她表示：「製造顯微鏡的好處就是你能得到別人得不到的答案，而壞處就是你必須自己解決遇到的所有問題，但那很有趣！」

DIY指南

無論是為了促進顯微技術發展還是解決特定生物問題，製造新顯微鏡的過程都大致相同。Keller對此相當有經驗，他表示「我們致力於製造新顯微鏡好幾年了」，並對製造顯微鏡的過程進行了精鍊總結（參見「DIY顯微鏡的十個步驟」）。

Keller認為一個優秀的顯微鏡團隊應該包括一位物理學家或生物醫學工程師來管理項目運行，同時還需要至少四類專家提供支持：一位光學工程師來進行光學設計，一位機械工程師來將各部分組合成一個整體，一位軟體開發人員來為機器設計程序，同時還需要一位計算機科學家將原始數據轉化為可利用的圖像。

顯微鏡DIY的十個步驟

製造顯微鏡的過程是複雜的，但物理學家Philipp Keller將其提煉為十步：

? 搜集設計靈感

? 光學設計方案及試驗

? 利用計算機輔助設計軟體設計顯微鏡主體及用戶定製部分

? 訂購相關部件，並製造定製機械元件及光學元件

? 測試各元件性能及整合的難易度

? 組裝顯微鏡原型

? 編碼顯微鏡控制軟體

? 根據性能測試結果優化定製元件

? 進行驗證試驗

? 開發並優化圖像處理軟體

第一步是光學設計。光學工程師利用專業軟體，如Keller和Legant所使用的OpticStudio（華盛頓州柯克蘭Zemax公司產品），在虛擬空間完成光學設計，決定入射光、鏡頭、反射鏡以及其他實現解析度和相關所需特性的光學元件如何正確排列。

機械工程師隨後將解決如何在現實世界中將這些部件組合在一起，如把物理元件與光學平台連接起來。「此時顯微鏡好像是一系列鏡頭排列成行，懸浮在空中，而將它真正變成實物的人是我。」與Keller合作的機械工程師Brian Coop說。

Coop表示此階段的最大挑戰是要嚴格遵守苛刻的物理條件限制。顯微鏡在聚焦於微米甚至納米級的對象時，幾乎沒有誤差的空間。鏡頭、反射鏡和光源必須精確校準從而產生可用、清晰的圖像，他需要考慮到一些微小的改變，如金屬熱膨脹可能會改變校準 。Coop指出：「重視光學校準的準確性能簡化之後的所有步驟。」

Coop製造顯微鏡時會盡量使用現成的部件，或對重新利用之前顯微鏡的某一部件。但每個顯微鏡都會有一些定製部分，這就需要Coop在珍妮莉婭?法姆研究學院的機械車間內進行設計甚至生產。

以Keller最新的顯微鏡為例，其樣品室能夠容納四個物鏡浸入樣品所在的介質中。顯微鏡必須被密封以防止漏液，但同時還要允許鏡頭獨立移動。此外物鏡排列緊密，相互之間僅有100微米間隙，且大小形狀各不相同，因此Coop必須調整樣品室和密封圈從而實現每一種可能的組合。他估計設計和製造每個樣品室需要兩到三天，花費800到1000美元。

當光學工程師和機械工程師組裝好顯微鏡原型時，軟體開發人員和計算機科學家便加入進來，確保各部件有序運行並且能夠得到可用圖像。許多顯微鏡製造者利用名為LabVIEW的商業軟體包來控制顯微鏡，但隨著機器越來越先進，有時還需要定製的方案，珍妮莉婭?法姆研究學院一名程序員Daniel Milkie表示。

他說：「我們在設計超越硬體極限的新工具、新類型顯微鏡，因此需要設計專門的軟體來使其性能最大化。」關鍵在於要確保軟體能夠根據新需求（例如大量的檢測器）快速靈活地進行調整。因此，Milkie使代碼模塊化，這意味著能夠簡單地整合新元素而不必從頭重新開始。

但是軟體方面最大的挑戰是解決如何處理顯微鏡生成的大量數據。高速相機每秒能生成十億位元組數據，一些機器甚至同時運行多台相機。Milkie稱僅Betzig實驗室每年便可產生50-100萬億位元組數據，他說：「產生了這麼龐大的數據量，它們該何去何從？」

成品看起來與傳統顯微鏡截然不同。所有部件（反射鏡、鏡頭、光源、相機和樣品室）通過許多槓桿和夾子固定到一個數噸重的平台上，避免顯微鏡受到振動。Legant將其比作一個複雜的樂高玩具。

Keller估計從頭開始製造一個顯微鏡需要至少一年，如果團隊能重複利用之前裝置的部件和軟體，則能少點時間。由於定製要求越來越高端，顯微鏡開發也變得越來越昂貴。2005年Keller製造DSLM顯微鏡花費了約5萬美元，而其後顯微鏡的花費高達10到20萬美元。他2015年最新製造的各向同性多視圖顯微鏡耗費了一百萬美元。Keller認為花5萬美元製造一個顯微鏡並且能說它改進了現有工藝水平的時代已經一去不復返了。

定製顯微鏡的注意事項

定製顯微鏡需要更高的使用技巧，因為它常常需要針對每次實驗做大量設置及校正，這種人為調整是商業顯微鏡生產廠家極力避免的。但Waterman認為這不應該成為一個障礙，因為相關原理在基礎顯微鏡課程中都應該學到。

已發表的新型顯微鏡系統相關的研究常常會包含設計方案和部件清單。對於想獲得更多指導的人，珍妮莉婭?法姆研究學院已將顯微鏡相關設計方案和軟體製作成免費網路資源，並且提供關於顯微鏡製造過程的幫助。Legant表示網站上有約20小時的視頻教程來演示如何組裝調整所有部件，還包括其他專業知識資源。

一些網站，如美國國立生物醫學成像和生物工程學研究所光學成像項目的生物物理學家Hari Shroff建立的http://diSPIM.org，德國普朗克分子細胞生物及遺傳研究所Pavel Tomancak發育生物實驗室始建的http://OpenSPIM.org，以及西班牙巴塞羅納光電子科學研究所Emilio Gualda所領導的OpenSpinMicroscopy，都免費提供各種光片顯微鏡配置方案。

儘管按照現有方案製造顯微鏡比從頭開始設計簡單，但仍需要相關光學、機械、電子、計算機編程及生物學知識。Gualda表示最大的優勢是價格。OpenSpinMicroscopy提供的商用選擇性平面光顯微鏡約為20萬美元。而如果利用Gualda的開源軟體以及如Arduino控制器等不昂貴的硬體，他估計研究者只需花費四分之一的價格就可以製造一台高質量的顯微鏡。「並且還能夠根據需求進行自定義，」Gualda補充道。

另外還有用戶可以獲得建議並交換意見的在線論壇。2014年，哈佛醫學院分子生物學家Srigokul Upadhyayula曾與Legant一起製造第一台晶格層光顯微鏡，他認為這種類型的合作代表了科學家工作方式的巨大改變。「過去每個研究者都是孤立的，這類團體很少見。」

對Legant而言，他正在準備在北卡羅萊納大學成立自己的實驗室。他將在這一職位上繼續研究細胞生物學和顯微鏡設計。他的首批項目之一將是重新研究細胞如何運動。他說：「我們最新的系統解決了技術問題，但還未有機會來應用它解決實際問題。」如今既然已經創造出研究所需的工具，Legant或許終將得到他追尋多年的答案。?

Nature|doi: 10.1038/d41586-017-07528-7

原文發布在2017年11月28日的《自然》科技專題上

原文作者：Brian Owens

點擊右邊標題閱讀英文原文：The microscope makers

版權聲明：

本文由施普林格·自然上海辦公室負責翻譯。中文內容僅供參考，一切內容以英文原版為準。歡迎個人轉發，如需轉載，請郵件Chinapress@nature.com。未經授權的翻譯是侵權行為，版權方將保留追究法律責任的權利。

?2018 Springer Nature Limited. All rights reserved.