史上最易懂的流式細胞實驗設計指南

史上最易懂的流式細胞實驗設計指南

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流式細胞術是非常讓人著迷的實驗。在眾多醫學研究手段里，如果說弱水三千只取一瓢的話，那我會首選流式細胞術。從我個人感受來講，流式細胞術高速客觀，具有統計學意義，能夠處理複雜樣本並同時獲取多種參數，最最關鍵的是它性能可靠，可重複性非常好。

雖然也存在一些局限，但流式細胞術比起傳統的細胞生物學研究手段來講完全可以獲得「獨孤求敗」的桂冠了；如果算上共聚焦和膜片鉗，當真可以算拉動現代細胞生物學的「三駕馬車」了。

什麼是流式細胞術

雖然介紹流式細胞術的入門文章很多，很多同學也對流式細胞術耳濡目染已久，看師兄師姐做過無數，可真到自己做的時候卻又總出問題。據毛老師多年觀察，很多同學在實驗設計的時候就埋下了隱患，最常見的問題就是對照設置不合理，最後導致整體實驗失敗或數據不理想。因此，今天我們來談談成功的流式細胞實驗設計都需要設置哪些對照。

毫不誇張地說，設置合理的對照組是整個實驗成功的關鍵；反過來說，如果你掌握了流式實驗如何設置對照的精髓，對整個免疫學相關的實驗設計都會有極大地幫助。

流式對照至少有 5 種：生物學對照，空白對照，同型對照（Isotype control），補償對照（也叫單陽性對照）和 FMO 對照，主要目的是為了避免出現的假陽性或假陰性結果。下面我們以一個具體的凋亡實驗來看看如何設置對照組。下圖是 Annexin V/PI 檢測凋亡的原理示意圖。

Annexin V/PI 檢測凋亡的原理示意圖

比如有兩組細胞，一組給予藥物處理（Treat 組），一組給予 DMSO 溶劑（Vehicle 組），擬用 Annexin V/PI 檢測凋亡，我們來看看都需要設置哪些對照。

1、生物學對照

這個很容易理解，也是很多同學最早設立的對照。這裡 Vehicle 組就是生物學對照組。可能很多同學想像力就局限於此了，有了生物學對照就夠了唄，還需要額外對照嗎？答案是肯定的，別忘了流式細胞術也是一種免疫學實驗，下面我們繼續來設置對照。

2、空白對照

在流式上機檢測前，我們還需準備額外一組細胞（正常或處理過的皆可），什麼染料也不加，作為空白對照。為什麼要設置空白對照呢？除了陽性熒光信號之外，我們還需要排除樣本是否自帶熒光背景，所以要用空白對照來驗證在各個檢測通道上的信號是否都是陰性。

3、同型對照（Isotype control）

這個對照很多同學都比較陌生。這個還得從抗體結構說起。大家知道抗體是個 Y 字形的，Fab 區域是特異性識別抗原的。在做蛋白免疫印跡時，只需考慮 Fab 的特異性就可以了，但是細胞的話稍微有點不同，因為有些細胞，特別是免疫細胞（B 細胞，T 細胞，巨噬細胞等等），它們表面有 Fc 受體，所以這個同型對照是為了評估抗體 Fc 段與靶細胞的結合情況。如果還不懂的話請看下圖。

對比圖

所以在做免疫細胞的流式檢測時，我們通常都需要加入 Fc 受體封閉劑，之後再加入目標抗體的 isotype 作為同型對照，來排除細胞 Fc 受體造成的假陽性結果。一般試劑商都會告知該抗體需要使用哪種同型抗體。

請輸入圖片描述

4、補償對照（單陽性對照）

要理解這個對照，首先需要知道什麼是熒光補償。一圖勝前言，下面這個示意圖說得比較明白。

補償對照（單陽性對照）

簡單來說，需要使用幾種顏色的抗體，就需要設置幾種顏色的單陽性對照。這個對照可以用細胞來做，也可以特殊的微球的來做。這裡嚴重推薦使用補償微球來作為補償對照，一是能節約時間和樣本，二是，有時候自己做的單陽性對照效果不佳，陽性信號不強，就失去了補償對照的意義了。下圖是我用補償微球的效果。

補償微球的效果

5、熒光減一（FMO，Fluorescence minus one）對照

如果只用到兩種顏色的話，這個對照可以用單陽性對照代替，如果三種以上顏色的話，就需要再設置 FMO 對照來評估其他熒光染料的干擾和補償本底，幫助正確設置陽性門。

下圖演示如果按空白對照組設定界線之後得到的細胞比例比 FMO 設定的值要大。從這個圖可以看出，空白對照僅僅是設定陰性界線，但非陰性並不等於就是陽性，所以還需 FMO 來設定陽性界線。再打個比方，比如人體體溫正常是 37°，小於 37° 肯定不是發熱，那超過 37° 就一定是發熱嗎，比如 37.1°？（發熱的診斷界線是 37.3°）。

熒光減一（FMO，Fluorescence minus one）對照

所以，綜上所述，如果只檢測兩種顏色的話，至少需要 5 個對照（生物學對照 + 空白對照 + 同型對照 + 2 個單陽性對照）。如果要檢測 3 種顏色的話，我們來算算，生物學對照 + 空白對照 + 同型對照（可以不同的 isotype 做在同一管里）+3 個單陽性對照 + 3 個 FMO 對照，一共需要 9 個對照。

熒光減一（FMO，Fluorescence minus one）對照

?只有設置了合理的對照，才能得到準確可靠的結果，小夥伴們 get 到了嗎？下次再去做流式，就不會被流式的老師懟得無地自容了吧。如果覺得對您有所啟發，請點個贊哦，要是感興趣的同學比較多，我們下次再繼續談談樣本處理和顏色搭配的問題。

最後想提一點冷知識，流式細胞術（Flowcytometry）是近年來流行起來的叫法，但它和 FACS 嚴格來說不是同一個意思，FACS 意思是 Fluorescence activated Cell Sorting，以前老一輩們都叫熒光激發細胞分選實驗，S 是分選的意思，但實際上很多流式細胞儀還只能做到檢測分析，不能實現分選，我們只是習慣用 FACS 來指代流式細胞檢測術而已。

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