殊途同歸的CTLA4與PD1

殊途同歸的CTLA4與PD1

CTLA-4

CTLA-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，也叫CD152）是免疫球蛋白家族的成員，CTLA-4蛋白由CTLA-4基因編碼，位於人2號染色體（2q33.2），小鼠1號染色體。

1995年，Tak Wah Mak 和 Arlene H. Sharpe 兩家實驗室分別利用CTLA-4基因敲除小鼠模型發現了CTLA-4基因負調控T細胞活化的功能。

在活化的T細胞表面表達，與CD28（T細胞共激活因子）同源，兩者均可與抗原提呈細胞表面的CD80和CD86（也叫b7-1和b7-2）結合。CD28負責傳遞激活信號，活化T細胞；而CTLA-4負責傳遞抑制信號給T細胞，讓T細胞不會殺傷其它細胞，包括腫瘤細胞。並且CTLA-4與CD80和CD86的親和力要高得多，因此會競爭和阻斷CD28的激活作用。

在靜息的幼稚T細胞中，CTLA-4主要位於胞內，TCR和CD28：B7結合產生的刺激信號通過含有CTLA-4的囊泡的胞吐作用誘導CTLA-4異位到細胞表面。 通過CTLA-4：B7競爭結合產生負調控信號，通過抑制IL-2產生和細胞周期進展來防止T細胞的完全活化。

CTLA-4還參與其它的免疫控制途徑。 調節性T細胞（Tregs）組成型表達CTLA-4，CTLA-4 KO小鼠模型中Tregs控制效應T細胞的功能被削弱，說明CTLA-4對Tregs功能也很重要。有研究認為Tregs控制效應T細胞的一種機制是APC上B7配體的下調，導致CD28共刺激減少。

PD-1

PD-1是共刺激受體B7 / CD28家族的成員，由PDCD1基因編碼，位於人2號染色體、小鼠1號染色體。

它通過與其配體程序性死亡配體1（PD-L1）和程序性死亡配體2（PD-L2）結合來調節T細胞活化。與CTLA-4信號傳導類似，PD-1結合抑制T細胞增殖， 和干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子TNF-α和IL-2的產生，並降低T細胞存活率。PD-1及其配體是T細胞耗竭過程中最主要的抑制性受體。

CTLA-4 vs PD-1

相同之處

• 在活化的T細胞表面表達
• 表達水平受tcr信號影響
• 降低T細胞的增殖、葡萄糖代謝、細胞因子產生和存活

不同之處

anti-CTLA-4 vs anti-PD-1

針對CTLA-4通路與PD-1/PD-L1通路的靶向藥物包括：

利用CTLA-4抗體和PD-1抗體分別阻斷CTLA-4和PD-1之後，抗PD-1主要誘導特定腫瘤浸潤的耗竭CD8 T細胞亞群的擴增；抗CTLA-4在此基礎上還誘導了ICOS+ Th1-like CD4 T細胞擴增。雖然它們都會使CD8+ T細胞增加，但其實是各自通過不同的細胞機制來實現的：anti-PD-1主要是通過觸發線粒體氧化磷酸化途徑，而anti-CTLA-4則能觸發胞內大多數信號途徑，其中還包括細胞周期調控途徑。

儘管PD-1和CTLA-4靶向治療已經能夠提高癌症患者的平均預期壽命，但仍有諸多局限性。雖然CTLA-4抗體和PD-1抗體的聯合或順序療法正在火熱展開，但對於療效、用藥的持久性和副作用的研究都還剛剛起步，都凸顯出該領域進一步創新的必要性。

構建免疫檢驗點人源化小鼠模型，使科研人員能夠研究只識別人體免疫檢驗點的藥物。 人源化小鼠為研究靶定人體免疫檢驗點的檢驗點抑製劑提供了可能性，並且在臨床試驗前更精準的預測藥物功效以及可能的副作用（如自身免疫，促炎症等）。

南模生物已開發出CTLA-4、PD-1、PD-L1三種已驗證的人源化小鼠模型，用以測試靶向人體免疫檢驗點的藥物。

人源化小鼠及驗證數據

CTLA-4-HU

構建策略

CTLA4人源化小鼠構建策略。在 C57BL/6J 遺傳背景下，將人源 CTLA4 蛋白編碼序列插入小鼠 Ctla4 基因的 ATG 位置，在表達全人源 CTLA4 蛋白的同時取代小鼠內源 Ctla4 的表達。

驗證數據

CTLA4人源化小鼠流式分析（FACS）數據

FACS 檢測CTLA4 人源化小鼠活化後脾臟淋巴細胞的CTLA4 表達。CTLA4 人源化純合子小鼠脾臟淋巴細胞經anti-CD3 和anti-CD28刺激 72h 後收集細胞染色，FACS 檢測人源CTLA4 表達。結果顯示：CTLA4 人源化純合子小鼠活化的CD4+ 和CD8+ T 淋巴細胞中可以檢測到人源CTLA4 的活躍表達。（與CrownBio 合作完成）

· CTLA4人源化小鼠MC38荷瘤模型體內驗證結果

圖4. CTLA4人源化小鼠模型的抗CTLA4人源化抗體Ipilimumab 體內抗腫瘤效果。 (數據為與信達生物製藥有限公司合作完成)

分組和給葯以及檢測：將MC38結直腸癌細胞接種於CTLA-4轉基因小鼠右側背部皮下，成瘤後隨機分為2組，然後分別給予Ipilimumab 10 mg/kg或者等體積生理鹽水進行治療，每周給葯2次，連續給葯4次，每次給葯前測定腫瘤體積。

實驗結果：抗human-CTLA4藥物Ipilimumab能夠顯著抑制MC38腫瘤在CTLA-4小鼠體內的生長，給葯1周後即可檢測到腫瘤抑制效果，給葯2周後可見非常顯著的抑制效果（如上圖），同時Ipilimumab治療組有2隻動物腫瘤完全消失，而對照組則腫瘤持續生長。

CTLA4 人源化小鼠 MC38 荷瘤模型體內抗腫瘤藥效驗證。CTLA4 人源化純合子小鼠接種 MC38 結腸癌細胞系，腫瘤生長至約 100 mm3隨機將動物分組為對照組和治療組（n=9）。結果顯示： 針對人的 CTLA4 陽性藥物 Yervoy 有非常顯著的抗腫瘤效果（p<0.001），證明CTLA4 人源化小鼠是一個很好的驗證針對人 CTLA4 抗體藥效的體內模型。

PD-1-HU

構建策略

PD-1人源化小鼠構建策略。在 C57BL/6J 遺傳背景下，將人源 PDCD1 蛋白編碼區插入小鼠 Pdcd1 基因的 ATG 位置，在表達人源全長 PDCD1 蛋白的同時，取代小鼠內源 Pdcd1 的表達。

驗證數據

· PD-1人源化小鼠T細胞流式分析（FACS）數據

PD-1人源化小鼠T細胞經ConA激活後流式分析（與 Genscript 合作完成）。FACS 檢測 PD-1 人源化小鼠脾臟淋巴細胞 PD-1 表達。PD-1 人源化純合子小鼠和野生型小鼠取脾臟 T 淋巴細胞，體外 ConA 刺 激 24 小 時 後，FACS 檢 測 人源 PD-1 在 T 細胞表面表達。結果顯示：ConA 體外刺激後，在 PD-1 人源化小鼠 T細胞表面可以檢測到人源 PD-1 蛋白表達。

· PD-1人源化小鼠MC38荷瘤模型體內驗證結果

A. 腫瘤組織平均體積±SEM。（與 Genscript 合作完成）

PD-1 人源化小鼠 MC38 荷瘤模型體內抗腫瘤藥效驗證。PD-1 人源化純合子小鼠接種 MC38 結腸癌細胞系，腫瘤生長至約 100 mm3隨機將動物分組為對照組和治療組（n=8），每周給葯兩次，連續給葯四次。結果顯示：針對人的 PD-1 陽性藥物 Keytruda 有非常顯著的抗腫瘤效果（p<0.001），證明 PD-1 人源化小鼠是一個很好的驗證針對人 PD-1 抗體藥效的體內模型。

B. 腫瘤組織平均體積±SEM。C. 小鼠平均體重±SEM。 ( 與 PharmaLegacy 合作完成 )PD-1人源化小鼠MC38 荷瘤模型體內抗腫瘤藥效劑量驗證。PD-1 人源化純合子小鼠接種 MC38 結腸癌細胞系，腫瘤生長至約 90 mm3隨機將動物分組為對照組和治療組（n=9）。結果顯示：針對人的 PD-1 抗體有非常顯著的抗腫瘤效果（p<0.001），且這種抗腫瘤效果呈現出劑量效應。

PD-L1-HU

構建策略

PD-L1人源化小鼠構建策略。在 C57BL/6J 遺傳背景下，將人源 PD-L1 蛋白編碼序列插入小鼠 Pd-l1 基因的 ATG 位置，在表達全人源 PD-L1 蛋白的同時取代小鼠內源 Pd-l1 的表達。

驗證數據

· PD-L1人源化小鼠T細胞流式分析（FACS）數據

FACS 檢測 PD-L1 人源化純合子小鼠和野生型小鼠脾臟淋巴細胞 PD-L1 表達。結果顯示：在人源化 PD-L1 純合子小鼠脾臟 T細胞和 B細胞中均可以檢測到人源PD-L1 的表達。（與 CrownBio 合作完成）

PD-L1人源化小鼠MC38荷瘤模型體內驗證結果

PD-L1 人源化小鼠 MC38 荷瘤模型體內抗腫瘤藥效驗證。PD-L1 人源化純合子小鼠接種 MC38 人源化結腸癌細胞系（表達人源 PDL1，不表達鼠源 PD-L1），腫瘤生長至約 100 mm3隨機將動物分組為對照組和治療組（n=5）。結果顯示： 針對人的 PD-L1 抗體有非常顯著的抗腫瘤效果（TGI: 抑瘤率 , p<0.01），證明 PD-L1 人源化小鼠是一個很好的驗證針對人 PD-L1 抗體藥效的體內模型。

參考文獻

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