做實驗丨這些原代細胞培養的誤區，不能再犯了！

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原代細胞培養

也叫初代培養，是指從供體取得組織細胞後在體外進行的首次培養，原代取材是進行組織細胞培養的第一步。

【基本要求】

1.取材的組織需儘快培養（特殊情況可將組織於4℃低溫保存，但時間不能超過24h）

2.嚴格無菌操作

3.盡量使用鋒利的器械，減少對細胞的機械損傷

【實驗步驟】

【東澳產品】

1）大/小鼠神經幹細胞原代取材培養培養並凍存

來自孕齡13.5天的SD鼠胚胎大腦的海馬和室管膜下區，用神經幹細胞完全培養基。傳代擴增至第二代凍存。

2）膠質瘤幹細胞原代取材培養並凍存

使用腫瘤幹細胞培養基培養U87-MG細胞獲得的人膠質瘤幹細胞。經過多次富集和分離獲得穩定的細胞株後凍存。

在原代細胞培養中，大家難免會遇上這樣那樣的問題——

1.原代細胞在水浴中解凍一段時間

原代細胞對解凍過程非常敏感，因此將小瓶置於37℃水浴中，保持並輕輕旋轉直到內容物剛剛解凍是很重要的。然後應立即從水浴中取出小瓶，並轉移到無菌操作台。確保您的培養瓶在解凍前已經準備就緒，以便可以立即用於接種細胞，並置於培養箱中。

2.解凍match小瓶後直接離心

我們不建議在解凍後離心細胞，因為離心程序比少量的DMSO殘留更有害。記住，在恢復原代細胞後的第二天更換培養基以去除任何殘留的DMSO。

3.允許原代細胞變得過於融合

當生長至100％匯合時，原代細胞可以變得衰老。記住，原代細胞不是100％純，因此重要的是盡量減少污染細胞的生長。我們建議在細胞達到90-95％融合時，對原代細胞進行傳代培養。

4.傳代時過度胰蛋白酶消化

當細胞傳代時，使用低濃度的胰蛋白酶並在顯微鏡下密切監測細胞。此外，記得在胰蛋白酶消化後完全中和細胞中的胰酶，因為任何活性的胰蛋白酶都將損傷細胞。

5.原代細胞易重新凍存

通常我們不推薦重新凍存原代細胞，因為這可以促進細胞衰老和/或導致功能變化。原代細胞非常敏感，重新凍結可能導致細胞死亡或損傷。

錯誤糾正後需要注意實驗操作中的這些細節——

1.應如何進行凍存細胞的培養？

下列步驟以單管凍存細胞進行培養的實驗方案為例。

• 準備一燒杯37°C的水。
• 從液氮儲存中取出一管細胞，注意保護手和眼睛。
• 擰松管蓋1/4圈，等待10秒鐘以釋放螺紋中可能殘留的液氮，再重新擰緊管蓋。
• 將凍存管的下半部分置於37°C水浴中進行解凍，直至凍存管內僅剩餘一小塊冰芯，使細胞迅速解凍。
• 用消毒液擦拭管體外表面，再將其移至II級A型層流細胞培養通風櫥中。
• 打開管蓋，使用1 mL移液器上下吹打細胞懸液以分散細胞。

台盼藍染色

• 從管中吸取20 uL細胞懸液，並將其稀釋於20 uL台盼藍溶液中。
• 使用血細胞計數板來確定每毫升懸液中的活細胞數。
• 將管中懸液（1 mL）稀釋至產品說明中的推薦濃度。
• 將5 mL細胞懸液加入25 cm2培養瓶，或將15 mL細胞懸浮液加入75cm2培養瓶中。
• 搖勻培養瓶中的培養基以徹底分散細胞。許多類型的細胞都會迅速貼壁，如果沒有在傳代後即刻搖勻細胞，細胞可能生長不均勻。
• 在37°C、5% CO2/95%空氣、濕度細胞培養箱中培養細胞。為了獲得最佳結果，培養開始後至少在24小時之內不要擾動細胞。

2.是否可以對擴增後的細胞重新凍存？

當從細胞庫購買的凍存或正處於增殖期的細胞，可對其進行擴增和重新凍存。不過，凍存操作可能會對細胞的生長狀態有所影響。下列實驗方案為大家提供了一份使用無蛋白成份的凍存培養基凍存細胞的基礎指南。

請注意：由於凍存設備與個人技術之間的差異，我們無法確保使用本方案凍存的細胞在復甦後能夠保持活力，我們也無法為研究用戶實驗室凍存細胞的效果進行擔保。

細胞凍存（常用的凍存液：90% FBS+10%DMSO）

• 使用37°C水浴化凍無蛋白成份的凍存培養基或4°C條件下過夜化凍。
• 如果在水浴中進行化凍，請確保溫度不要超過37°C，也勿將該產品延長時間置於37°C。
• 無蛋白成份的凍存培養基在使用前應置於4°C條件下徹底平衡。為獲得最優結果，推薦大家使用能夠控制變溫速率的冰箱。如果缺少能夠控制變溫速率的冰箱，也可使用細胞凍存盒。
• 如需用酶試劑解離培養器皿表面的細胞，則需使用對應的終止溶液重懸細胞以中和酶的效果。
• 通過離心沉澱細胞。
• 去除上清液後，使用預冷的無蛋白成份的凍存培養基以5x10E5至3x10E6細胞/毫升的密度重懸細胞。
• 將細胞懸液分裝至合適數量的凍存管中。
• 將細胞儘快冷卻至4°C。
• 如果使用控制變溫速率的冰箱：以每分鐘降低1°C的速率冰凍樣品，直至–40°C。之後按照每分鐘降低2°C的速率降至–90°C左右。
• 如果使用細胞凍存盒：請按照說明書來準備凍存盒。
• 為獲得最佳結果，推薦大家在細胞溫度降至–80°C後，儘快將凍存管轉移至液氮儲存設備的氣相中。
• 作為無蛋白成份的凍存培養基的替代品，可使用該凍存細胞推薦的基礎培養基，添加90%胎牛血清（FBS）和10% DMSO進行細胞凍存。

組織塊貼壁法分離細胞時：注意組織塊貼壁2-3h後，補液時沿壁輕輕加入培養基，防止組織塊漂浮。