【轉載】Illumina的SNP晶元原理

09-09

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Illumina的SNP晶元原理

Illumina的SNP生物晶元的優勢在於：

第1，它的檢測通量很大，一次可以檢測幾十萬到幾百萬個SNP位點

第2，它的檢測準確性很高，它的準確性可以達到99.9%以上

第3，它的檢測的費用相對低廉，大約一個90萬位點的晶元（每個樣本的）檢測費用在一、兩千人民幣

Illumina的生物晶元系統，主要是由：晶元、掃描儀、和分析軟體組成。

Illumina的生物晶元，由2部分組成：第1是玻璃基片，第2是微珠。

這個玻璃基片，它的大小和一張普通的載玻片差不多大小，它起到的作用，就是給微珠做容器。

在這個玻璃基片上，通過光蝕刻的方法，蝕刻出許多個排列整齊的小孔。每個小孔的尺寸都在微米級，這些小孔是未來容納微珠的地方。小孔的大小與微珠正好相匹配，一個小孔正好容納一個微珠。

微珠是晶元的核心部分，微珠的體積很小，只有微米級。

每個微珠的表面，都各偶聯了一種序列的DNA片段。每個微珠上，有幾十萬個片段，而一個珠子上的片段，都是同一種序列。

這些DNA片段的長度是73個鹼基，而這73個鹼基又分成2個功能區域。

靠近珠子的這一端的23個鹼基的序列，被稱為Address序列，它也是DNA片段的5端。它是標識微珠的標籤序列。標籤序列，通過鹼基的排列組合，得到許多可能，每種序列，就是相應微珠的身份證號碼（ID號）。

DNA片段上離珠子遠的那一端的50個鹼基，也就是3端的序列，被稱作Probe序列，它的作用，是與目標DNA進行互補雜交。

一種Address序列，就對應了一種probe序列。它們之間有著一一對應的關係。

在Illumina生產晶元的過程當中，是把要做晶元的幾十萬種微珠，按設定的比例進行混合好，撒到玻璃基片上。微珠隨機地落入基片的小孔當中，然後，通過檢測晶元上每個小孔當中的微珠上的Address序列，就可以知道，這個小孔當中是哪種微珠。

2. 又因為Address序列和Probe序列有著一一對應的關係，這樣，也就知道了每個小孔當中，有哪種Probe。反過來說，也就知道了每種Probe分布在哪幾個小孔中了。

所以，Illumina公司出廠的每一張晶元，都要跟一個「.dmap」文件。這個.dmap文件，標註了每一張晶元上，每一個微孔當中，分別是哪種微珠。

用戶做完晶元實驗，得到掃描數據後，要從Illumina的網站上下載這張晶元的對應dmap文件，然後才能解讀這張晶元。

在一張晶元的一個反應（樣本位）當中，每種珠子平均有約15顆或更多。

說完了Address序列的功能，接著我們來說Probe序列的功能。

Illumina的生物晶元掃描儀，是掃描2種（熒光）顏色的：紅色和綠色。而鹼基有4種：A、C、G、T，要用2種熒光顏色，在一次實驗當中，就區分出四種鹼基，就需要一些巧妙的設計。

在Illumina的SNP晶元Probe設計上，先把要檢測的位點，分成2種情況。

第一種情況是比較簡單的，我們先舉例來說明。如果一個SNP位點的野生型是「G」，突變型是「A」，那麼就設計一個探針。這個探針的3端的最末一個鹼基，就挨著這個SNP位點。

在實驗過程當中，目標片段通過互補雜交，結合到這個探針上，然後，加入四種帶標記的雙脫氧核苷酸。其中A、T兩種核苷酸是用DNP（二硝基苯）來進行標記的。C、G兩種鹼基是用生物素來標記的。同時，加入聚合酶，聚合酶就會在探針的3』末端，加上一個雙脫氧核苷酸，並同時捎帶連上一個標記物。

接著加入綠色熒游標記的鏈霉親合素，紅色熒游標記的抗DNP的抗體。綠色熒游標記的鏈霉親合素與生物素特異地結合，讓帶生物素的C、G鹼基顯出綠色。紅色熒游標記的抗DNP的抗體與DNP結合，讓帶DNP的A、T鹼基顯出紅色。

並且進一步加入生物素標記的抗鏈霉親合素的抗體、和DNP標記的，抗異種抗體FC端的抗體。加入這兩種抗體的作用，是使熒光信號得到進一步的級聯放大。

抗體結合完了之後，經過清洗，把遊離的抗體都給洗掉。在掃描儀下進行掃描。

如果發出的光是綠光，就說明這個SNP結合的位點，是個「G」鹼基的純合子。如果發出的是紅光，就說明這個SNP位點是個「A」鹼基的純合子。如果既有紅光、又有綠光，而且兩種顏色的光的光強差不多，就說明這個SNP位點是一個「A」和「G」的雜合子。

說明了上面的道理，那麼，A-C、A-G、T-C、T-G，這四種SNP情況都可以理解了。因為它們長出來的鹼基，最後都會被染成不同的顏色，所以，可以被輕鬆地區分。

那麼，接下來，你就會想，對於A：T，或者C：G型的SNP位點，該如何來區分。因為「A：T」會有同樣的紅色熒光，「C：G」也會有同樣的綠色熒光。

好，接著我們就來說，這第二種情況的SNP位點的區分方案。

剛才我們說了，第一種SNP位點的區分方案，是把探針設計到緊挨著SNP位點，但留出SNP位點，讓下一個延長的鹼基，按照互補原則，根據SNP位點的鹼基來生長。

那麼，這第二種情況的SNP，在設計探針的時候，最後一個鹼基，是蓋在SNP位點上的。而且是設計2種探針，如果SNP位點是「A」和「T」，那麼探針也設計「A」和「T」。並且分別蓋在SNP位點上面。

這2種探針，在與目標DNA片段結合的時候，如果最後一個鹼基是互補的，那麼接下來的延伸反應就會發生，新的帶標籤的雙脫氧核苷酸就會被加到探針鏈上。再接下來，就會被熒光抗體染色，在激光掃描的過程當中，就會發光。

反之，如果最後一個鹼基是不互補的，那麼接下來的延伸反應，就不會發生。當然，也就不會有標籤加到探針鏈上，再接下來，熒光抗體也就不會將之染色。在後面的激光掃描當中，就不會發光。

激光掃描的結果，如果末尾是A鹼基的探針發光，而末尾是T鹼基的探針不發光，那麼說明目標SNP位點上是一個「T」的純合子；反之，則是「A」的純合子；如果A和T的探針都發光，而且發光強度差不多，那說明SNP位點上是一個「A」和「T」的雜合子。

理解了Illumina的SNP晶元的工作原理，也就理解了它為什麼準確率比較高。因為它是通過「紅」或「綠」，和「有」或「無」，來區分一個SNP位點到底是哪種鹼基的。

轉自生物通and陳巍學基因