乙烯信號簡史 | 成也EIN2，敗也EIN2

乙烯信號簡史 | 成也EIN2，敗也EIN2

來自專欄菜鳥學飛記

通過上一講《「偉光正」EIN2》的介紹，我們了解到，EIN2是乙烯信號通路中第一個起正調控作用的關鍵因子，它「偉光正」的高大形象已經深入人心。既然EIN2在乙烯信號轉導通路中起到非常重要的作用，那麼人們自然會好奇，它到底是如何發揮作用的呢？我們已經知道，EIN2定位在胞質中的ER膜上，而植物接受乙烯信號後要引起生物體的應答，必然會涉及細胞核中基因的表達調控，那麼乙烯信號是如何通過EIN2從ER膜傳遞到細胞核中的呢？這一個又一個的問題，等著全世界的科學家們去回答。

2012年，是乙烯信號研究史上值得載入史冊的一年。因為就在這一年，來自世界各地的三個實驗室幾乎同時發表文章，為我們揭示了EIN2介導乙烯信號轉導的分子機制。

2012年8月， Joseph R. Ecker實驗室在Science發表題為Processing and subcellular trafficking of ER-tethered EIN2 control response to ethylene gas的文章，揭示了EIN2由ER到細胞核轉移的機制。在前期的研究中，Melanie M.A. Bisson等人通過保守結構域預測，在EIN2的C端發現了一個可能的核定位信號（NLS）。隨後，Ecker實驗室對該NLS的功能進行了深入研究。他們將野生型的EIN2-YFP融合蛋白轉化至突變體ein2-5中，可以恢復突變體的表型；而將NLS突變後的EIN2Fm-YFP轉化到ein2-5中後，突變體的表型並不能被互補，說明NLS是EIN2行使功能所必需的。

既然該NLS結構域是一個預測的核定位信號，那麼EIN2蛋白是否具有核定位信號呢？研究人員用乙烯處理轉化了EIN2-YFP融合蛋白的擬南芥發現，乙烯處理前EIN2-GFP定位在內質網上，而用乙烯處理10min後，即可在細胞核中發現EIN2-GFP的定位信號，並且隨著處理時間的延長，信號強度也逐漸增強。而將NLS突變後，乙烯處理無法使EIN2Fm-YFP轉移到細胞核。以上結果說明，乙烯處理會使EIN2由ER轉移至細胞核，並且這種轉移對EIN2行使正常的功能是必須的。

那麼，乙烯信號轉導中的什麼組分會影響EIN2的亞細胞定位呢？將EIN2-YFP分別轉化至受體突變體etr1-1，ctr1-1和轉錄因子突變體ein3-1eil1-1中，發現etr1-1中ACC處理前後EIN2-YFG都不會出現核定位信號，而在ctr1-1中EIN2-YFP會出現組成型核定位，在ein3-1eil1-1雙突中EIN2則能正常響應乙烯。以上結果說明ETR1和CTR1影響乙烯介導的EIN2由ER向細胞核的轉移，而EIN3和EIL1對EIN2的定位沒影響。

我們在《「偉光正」EIN2》中介紹過，按照保守結構域可將EIN2可分為兩段：N端和C端。N端有12個保守的跨膜結構域，決定EIN2的ER定位。將EIN2的C端（CEND）在ein2-5中過表達，即可導致光下生長的幼苗出現組成型乙烯反應，並可持續激活乙烯響應基因的表達。而本文作者也發現，定位於細胞核的EIN2-CEND足以植株表現出乙烯反應。因此他們推測，當乙烯處理後，EIN2的C端被蛋白水解酶剪切，隨後進入細胞核。為了驗證上述推測，通過western blot檢測乙烯處理後植物體內是否有內源的剪切後的EIN2形式存在。結果表明，乙烯處理後，確實在細胞核提取物中檢測到了分子量更小的剪切後的EIN2-CEND肽段。

那麼另一個問題就來了，EIN2的剪切位點在哪兒呢？Ecker實驗室使用了MS並結合Pseudo-Multiple Reaction Monitoring技術檢測EIN2可能的剪切位點，最終鎖定在第645和646個氨基酸之間。隨後，他們又使用了蛋白磷酸化組學方法，在空氣中生長的黃化苗中提取出的EIN2上發現了3個高水平的磷酸化位點。有意思的是，其中的一個位點S645正好也是可能的剪切位點。那麼，S645的磷酸化水平到底是否受乙烯影響呢？研究發現，空氣處理的野生型中EIN2的S645被磷酸化，而乙烯處理後卻不被磷酸化；而在ctr1-1突變體中，無法檢測到S645的磷酸化。以上結果說明，EIN2 S645的磷酸化需要CTR1。

CTR1介導的EIN2 S645的磷酸化對其剪切入核有什麼影響呢？研究人員在EIN2中引入了S645A的突變，使該位點喪失被磷酸化的功能。將突變後的EIN2轉化至ein2-5中，可使植株出現組成型乙烯反應，並使EIN2-YFP出現組成型的剪切和核定位。轉錄組分析也發現，S645A突變可在轉錄水平持續激活乙烯響應。而可模擬磷酸化的S645E突變則不能恢復ein2-5的表型，同時EIN2-YFP也無法剪切入核。以上結果說明，乙烯可以抑制CTR1對EIN2的磷酸化，使EIN2的C端被剪切入核。

有意思的是，幾乎與此同時，郭紅衛實驗室和Caren Chang實驗室發表的文章，得到了與該文章幾乎相同的結論。只能再一次感慨國際同行對於科技前沿問題的角逐和競爭有多激烈。都說文無第一武無第二，可是在學術圈，卻永遠只有第一，沒有第二。

我們知道，自然界中的萬事萬物都必須維持一種相對平衡的狀態，才能長久穩定地存在。既然EIN2在乙烯信號轉導中具有如此關鍵的作用，那麼它是不是就可以「為所欲為」，不受其他事物控制了呢？答案肯定是否定的，大自然絕對不允許如此不和諧的事情發生。

2008年Joseph R. Ecker實驗室在GENES & DEVELOPMENT上發表題為Interplay between ethylene, ETP1/ETP2 F-box proteins, and degradation of EIN2 triggers ethylene responses in Arabidopsis的文章，揭示了ETP1/ETP2調控 EIN2蛋白降解的機制。

我們在《「偉光正」EIN2》曾經介紹過，在前期研究中發現，EIN2 mRNA對乙烯處理並沒有反應。於是本文作者通過western blot檢測EIN2是不是存在轉錄後調控。他們使用蛋白合成抑製劑CHX處理，檢測EIN2蛋白的變化，發現CHX處理30min後，EIN2蛋白含量顯著降低，2h後基本檢測不到。說明EIN2蛋白的壽命極短，半衰期僅為30mim。進一步使用蛋白酶體抑製劑MG115和MG132處理，發現EIN2蛋白逐漸累積，並且還出現了分子質量更大的條帶，說明EIN2蛋白可能存在被修飾的狀態，並且很可能是泛素化修飾。進一步使用乙烯處理後發現，在野生型Col中EIN2蛋白會迅速累積，並且銀離子可抑制該過程的發生。而etr1-1突變可抑制EIN2的積累，ctr1-1突變則導致EIN2組成型積累，ein3eil1中EIN2蛋白對乙烯的響應不受影響，說明乙烯促進EIN2蛋白的積累和乙烯反應相一致，並依賴於EIN3和EIL1上游的組分。

為了進一步揭示EIN2轉錄後調控的機制，研究人員使用EIN2-CEND為誘餌，進行了酵母雙雜交篩選，篩選到了1個新的F-box蛋白ETP1（EIN2 TARGETING PROTEIN2）。經過蛋白序列比對，發現擬南芥基因組中還有另外一個蛋白和ETP1具有較高的一致性（50%），將其命名為ETP2。

將ETP1或ETP2過表達可以抑制EIN2的累積，並且轉基因植株表現出非常強的乙烯不敏感表型。使用amiRNA降低ETP1和ETP2 mRNA的表達會導致EIN2蛋白積累，並使轉基因植株出現組成型乙烯反應。另外，乙烯處理會降低ETP1和ETP2蛋白的含量，抑制它們與EIN2的互作。

綜上所述，當沒有乙烯時，ETP1/ETP2蛋白積累，通過泛素化途徑降解EIN2蛋白，關閉乙烯信號途徑；而有乙烯時，ETP1/ETP2蛋白被含量減少，EIN2穩定性增強，被切割入核，激活下游乙烯信號。

由此聯想到了韓信和蕭何的典故，不禁要感慨一聲：真是成也EIN2，敗也EIN2！

在乙烯的幫助下，EIN2總算成功從內質網上解離下來了，由此開始了向細胞核的「朝聖之路」。可是，這一路途註定不會一帆風順，中間又會發生怎樣精彩的故事呢？欲知後事如何，請聽下回分解：《乙烯信號簡史 | 入核「路漫漫」》。

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【參考文獻】

【1】Qiao, H., Shen, Z., Huang, S. S. C., Schmitz, R. J., Urich, M. A., Briggs, S. P., & Ecker, J. R. (2012). Processing and subcellular trafficking of ER-tethered EIN2 control response to ethylene gas. Science, 1224344.

【2】Bisson, M. M., & Groth, G. (2011). New paradigm in ethylene signaling: EIN2, the central regulator of the signaling pathway, interacts directly with the upstream receptors. Plant signaling & behavior, 6(1), 164-166.

【3】Ju, C., Yoon, G. M., Shemansky, J. M., Lin, D. Y., Ying, Z. I., Chang, J., … & Cooper, B. (2012). CTR1 phosphorylates the central regulator EIN2 to control ethylene hormone signaling from the ER membrane to the nucleus in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(47), 19486-19491.

【4】Wen, X., Zhang, C., Ji, Y., Zhao, Q., He, W., An, F., … & Guo, H. (2012). Activation of ethylene signaling is mediated by nuclear translocation of the cleaved EIN2 carboxyl terminus. Cell research, 22(11), 1613.

【5】Qiao, H., Chang, K. N., Yazaki, J., & Ecker, J. R. (2009). Interplay between ethylene, ETP1/ETP2 F-box proteins, and degradation of EIN2 triggers ethylene responses in Arabidopsis. Genes & development.

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