當人體胚胎在實驗室中有望活過第14天|Nature長文

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導語：新技術帶來的不僅是關於人體發育的突破性見解，還有日益凸顯的倫理問題。

時間拉回到2013年年中讓人高度緊張的兩周，英國劍橋大學發育生物學家Magdalena Zernicka-Goetz正在趕超一項世界紀錄——她和同事嘗試在實驗室里進行有史以來最長的人體胚胎培養，試圖摸索出這一小團細胞何以發育成一個複雜的多部位結構。

之前的研究都在持續一周後就中止了，但Zernicka-Goetz深知，一周後的人體發育還有很多值得深究之處。

研究人員最初使用的胚胎來自那些不再需要接受體外受精的女性所捐贈的。研究團隊將之前小鼠胚胎的培養方式稍加調整，先把細胞浸泡在特殊的培養基里，再放入培養箱中。由於胚胎樣本必須處於嚴格受控的環境中，研究人員每天只能移動一到兩次樣本，在顯微鏡下跟蹤它們的發育情況。

時間到了第六天、第七天、第八天。胚胎仍在頑強發育著。Zernicka-Goetz回憶道，「我們幾乎都屏住了呼吸，一天比一天激動。」研究團隊首次嘗試就堅持了12天，並最終達到13天。她說：「一切都難以置信。我高興壞了。」

與之前來自紐約的一支團隊一樣，Zernicka-Goetz團隊的成果也是過去五年來推動早期人體發育研究的為數不多的亮點之一。由於人體胚胎來源有限，研究人員對胚胎早期發育知之甚少。

好在細胞培養方法不斷改進，如今體外培養人體胚胎的時間已能延長至兩周。科學家使用CRISPR等基因編輯技術，構建人造「胚胎樣」結構，用來研究促進形成胚胎以及胚胎支持組織的細胞信號和作用力。

這些技術有助於闡明胚胎早期發育的關鍵過程，如胚胎植入——極小的胚胎一旦植入子宮內膜，就難以對它進行直接研究。全新高解析度數字圖像讓發育後幾周里的肌肉和神經生長一目了然。這些發現能讓研究人員更好地找到出生缺陷、發育障礙、甚至是流產的原因。

新技術帶來了新希望，但也把研究人員推入了未知的倫理境地。倫理學家和科學家在上世紀70年代末達成了「14天規則」 ，要求人體胚胎研究必須在受精後的14天內結束——14天是神經系統逐步成形的第一天，也是胚胎分裂的最後一天。

到目前為止，國際公認的14天規則一直是一個純假設的限制。位於紐約的黑斯廷斯中心（Hastings Center）的生物倫理學家Josephine Johnston表示，「並沒有人違反這個規則，但如今，要突破這個限制從技術上說是可行的。」

胚胎髮育

動物界許多物種的早期發育過程都驚人地相似，只是一些基因或信號稍有不同。在哺乳動物中，科學家對小鼠發育的分子作用機制研究得最為透徹，通過讓基因逐個失效來確定它們的功能。實驗所需的小鼠數量一般很易獲得，而且小鼠與人類的早期細胞類型和細胞組分較相似，小鼠胚胎因此成了人體胚胎髮育研究的適當替代選擇。

不過，研究人員也開始懷疑這種相似性究竟能達到什麼程度。加拿大多倫多兒童醫院的發育生物學家Janet Rossant表示，「隨著人們踏入人體早期發育研究的大門，人們也越來越認識到小鼠胚胎和人體胚胎雖然相似，但並不一樣。」

由於人體組織來源有限，科學家只能通過高效的基因編輯技術（如CRISPR-Cas9）來輔助探索胚胎的早期發育。又因為圍繞胚胎遺傳修飾的倫理爭議不斷，迄今為止，只有少部分研究團隊獲准開展這方面的研究。

來自倫敦弗朗西斯·克里克研究所（Francis Crick Institute）的發育生物學家Kathy Niakan團隊率先獲得了監管當局的批准。2017年，Niakan團隊報告了如何使用CRISPR-Cas9技術對一個同時在人體和小鼠胚胎幹細胞中表達的基因進行編輯。

敲除該基因後，人體胚胎會缺少一種名為OCT4的蛋白，導致胚胎無法發育成囊胚——囊胚中大約有200個細胞。相比之下，同樣敲除該基因的小鼠胚胎卻能發育成囊胚，之後逐漸萎縮。

這種差異呼應了一種越來越受到認同的觀點——即使在發育早期，一些具體的遺傳信息可能只對人類才有意義，如特定基因何時被激活等。

Niakan表示，「我們知道大多數體外受精的胚胎無法發育至囊胚階段」，雖然箇中原因尚不明確，但「明確胚胎里第一類細胞的形成通路有助於改善體外受精技術。」Niakan希望接下來可以研究那些引導一小部分囊胚細胞形成胚體的人體基因，而不是形成胎盤等支持組織的基因。

成功著床

發育成含200個細胞的囊胚後，小囊胚必須在子宮內膜著床才能繼續存活。一旦埋入子宮內膜（約第七天時），科學家基本無法繼續研究囊胚的發育。第一個挑戰就是如何觀察整個植入過程。從前，研究人員尚無可靠手段讓胚胎髮育時間超過一周。

如今，這個黑匣子終於被科學家打開。在2016年5月發表的兩篇論文中，Zernicka-Goetz團隊和紐約洛克菲勒大學的Ali Brivanlou團隊首次報告了能讓人體胚胎培養至12-13天的系統。

研究人員指出，只要以正確比例混合生長因子和營養物質，培養皿中的人體胚胎就能「植入」培養皿底部。尤其值得注意的是，胚胎植入後無需母體組織就能觸發早期重組步驟。Brivanlou回憶道，「當時我驚呆了，我原本認為人體胚胎在植入後根本無法存活超過一兩天。」

植入培養皿的胚胎比真實的胚胎要扁。（Brivanlou把植入過程比作降落傘著陸。）但這一胚胎培養著實打破了好幾項紀錄，超過之前動物實驗和通過流產等渠道獲得的人體組織樣本的有限研究的預期。

在最新的實驗中，胚胎在植入培養皿底部後，細胞外層開始分化成早期胎盤和其他類型的細胞，用於支持胚胎髮育。細胞內部也發育出胚體和卵黃囊前體，這是向胚胎輸送血液的早期結構。在快到14天時，兩個團隊都遵守14天規則，結束了實驗。

當時，一些胚胎已經停止了發育。不過研究人員表示，隨著技術的進展，這些培養系統將有助於揭示更多關於胚胎最初兩周的細節。

好幾個關鍵事件都會在第三周的原腸胚形成階段完成。從這時起，胚胎髮育出體軸，其中一端會慢慢發育成頭部。隨後，細胞開始遷移分化，形成三胚層，三胚層最終形成身體全部的組織和器官（見上圖「步步成長」）。這一過程非常重要，也是倫理天數限制在14天的主要原因。

一些研究人員開始尋找替代方法，通過人體幹細胞技術打造合成胚胎樣結構，就可以不受14天規則的限制。不過，這種胚胎缺少一些完全發育所必需的成分，植入後也無法發育成人類。

2014年，洛克菲勒大學的Brivanlou、Eric Siggia和同事報道了他們運用專門培養的人體胚胎幹細胞來模擬體外原腸胚形成過程。他們發現，一旦限制幹細胞只能在直徑幾百微米的圓形培養皿中生長，幹細胞會分化成「靶心」圖樣，其中包含的三類主要細胞會逐步發育成身體各部位。

從扁形蟲到靈長目，在幾乎所有動物中，這三類細胞都具有類似功能：中心的細胞成為皮膚、大腦和神經系統；外面一圈發育成肌肉、血液、骨骼和各種器官；最外圈的成為消化道和呼吸系統。

扁平的環狀看上去並不像真實人體胚胎的立體交叉三維結構。但在細胞和分子水平上，這種結構完全符合研究人員的預期。Siggia實驗室前博士後研究員Aryeh Warmflash說：「這個系統讓我們可以更好地剖析信號通路和細胞結局之間的關係。」

對這一系統的跟蹤研究揭示了胚胎細胞如何通過幾何和化學方法自組織成不同類型的組織。2016年，Brivanlou、Siggia和他們的團隊證實，幹細胞可以感知自己在這個圓形空間中的位置，並相應調整對生長因子的響應方式，這有助於形成離散的細胞區域。

在2017年預印本伺服器bioRxiv發布的一篇研究中，來自美國德州萊斯大學的Warmflash團隊證實，生長因子的動態也起到了作用；研究人員發現特定蛋白組會使信號傳導增強（統稱為Nodal信號通路），並從外向內呈波浪式擴散，最終形成不同類型的細胞。

Brivanlou團隊對這一體系做了更進一步的研究。今年5月，研究人員利用混合生長因子，誘導形成了「組織者」細胞。這些特殊細胞能在動物體內引導周圍細胞形成從頭到尾的體軸。不過，14天規則在一定程度上限制了科學家，使他們無法見證人體組織者細胞的活動。

面對人體胚胎研究的倫理和技術的雙重限制，Brivanlou只能把假定的人體組織者細胞群嫁接到發育中的雞胚胎上，並觀察嫁接的細胞群如何引導雞細胞發育出第二套雞神經系統。

生命保障

雖然大多數有關人體早期發育的研究都集中在胚胎本身，但許多其它組織對胚胎的存活也至關重要，比如包裹胚胎的羊膜囊和輸送氧氣及營養素的胎盤。

為了更好地了解羊膜囊的發育過程，研究人員用人體幹細胞創造了一個模型。去年，美國密歇根大學安娜堡分校的發育生物學家Deborah Gumucio、生物工程師Jianping Fu及其同事在凝膠中培養人體幹細胞，並在周圍搭建天然分子支架。

研究人員發現，細胞會自組織成類似羊膜囊的團狀物。大約24小時後，細胞團上打開了一個孔，慢慢地，細胞的一端逐漸變平，另一端逐漸拉長——這些都是原腸胚形成前的特徵。

雖然這個模型只複製了胚胎核和胎囊，其它支持胚胎存活的組織並不存在，但研究人員仍能識別出幫助形成這種不對稱結構的分子信號。Gumucio說：「可以挖掘的有用信息太多了，完全沒必要進一步打造出更完整的胚胎模型。」科學家讓胚胎樣培養物保持到第5天時（約對應9-14天的發育時長），就中止了實驗。

Zernicka-Goetz團隊嘗試培養出更完整的胚胎結構。2017年，他們聯合培養了兩類小鼠幹細胞，一類是形成胚胎本身的細胞，一類是幫助胎盤形成的細胞，也叫滋養層幹細胞。把這種合成結構放置在三維支架中，合成結構會在植入後發育成類似胚胎的結構。研究人員正在嘗試通過人體幹細胞創建類似的胚胎樣結構，這有助於進一步了解胚胎組織和胎盤等胚胎外組織間的相互作用。

一些實驗室不斷開發出越來越精密的合成模型（被稱為「胚狀體」），倫理問題也逐漸浮出水面。美國傑克遜實驗室（Jackson Laboratory）的幹細胞生物學家Martin Pera表示，「我認為這是片灰色地帶。我們要如何評價這些發育中的結構？」

許多倫理學家和科學家一致認為目前的合成胚狀體過於簡化，不適用於14天規則。但美國凱斯西儲大學的生物倫理學家Insoo Hyun認為，很難確定哪些特徵會讓胚狀體更加貼近現實。「構建超過14天、在植入子宮後能繼續發育的模型是完全有可能的。」

身體構造

研究人員在破解後期發育階段方面也取得了不小的進展，而大部分進展得益於組織染色和成像技術的提高。在2016年《科學》發表的一份報告中，阿姆斯特丹大學學術醫學中心的研究人員將卡內基科學研究院（Carnegie Institution for Science）保存的15000 個各類組織的切片進行了數字化處理。

這些組織切片是從流產、手術和屍檢中獲得的樣本，時間跨度從19世紀80年代一直到20世紀上半葉。這項研究以最初兩個月內的發育過程為對象，通過數字化手段，利用單個切片追蹤了近150個器官的輪廓，再把切片對齊，對原始胚胎進行三維模型重建，製作成互動式圖譜。

高解析度胚胎研究已經貢獻出不少發現。例如，人們總是認為發育過程中腎臟會向上生長而生殖腺會向下生長，但是該團隊發現，這其實是因為它們與椎骨的生長速度不同，導致它們看起來在向上或向下。

不過，卡內基這些切片的一大限制在於缺少分子標記物，因此很難識別出不同類型的細胞。為了彌補這一缺陷，法國國家健康與醫學研究院（INSERM）的Alain Chédotal在2017年發布了包含36個發育時間為6-14周的人體胚胎和胎兒的全新三維圖譜。Chédotal團隊採用組織透明法處理這些捐贈樣本，使之更易於在顯微鏡下成像，另外採用染色方法標記不同細胞類型。

最後的高解析度三維圖像清晰地展現了神經、肌肉、肺部和其它器官的發育過程。美國霍華德大學醫學院的Rui Diogo從事四肢肌肉發育的數據集挖掘工作，他說：「就細節來看，超過之前所有的效果。」

在Diogo團隊尚未發表的結果中，研究人員還發現了一些會隨發育逐漸消失或融合手部和腳部肌肉。Diogo說：「當我們還是胚胎時，我們有一些成年以後沒有的肌肉。」 除了這一意外發現，Chédotal也指出，雖然左右手的總體神經組織很類似，但在最初的7周到11周里，兩隻手的細微分支模式遵循不同的生長路徑。

發展領域

隨著技術的不斷改進，科學家希望可以更深入地理解人體發育，揭示出導致流產和出生缺陷的原因。

對胚胎早期發育的進一步關注也引發了更加激烈的倫理爭論。Zernicka-Goetz和 Brivanlou的延時實驗讓重新權衡「14天規則」利弊的聲音再次出現。

5月，萊斯大學貝克健康與生物科學研究所舉辦的一場會議邀請了30位美國科學家、倫理學家和其他領域專家，共同探討是否應該以及如何調整14天規則，Brivanlou和Johnston也參加了此次會議。

與會專家Hyun說：「我認為14天規則應該保留，同時允許特殊情況下請願破例。」

隨著這方面的研究結果不斷湧現，技術進步讓科學家既欣喜又不安。Johnston認為兩種情緒都值得重視，「驚奇和敬畏交織，讓我們無時不謹記這是人類最初的樣子，讓我們無刻不警醒這不是普通細胞而已。我想，這也是很多道德顧慮的來源。」?

Nature|doi:10.1038/d41586-018-05586-z

原文發布在2018年7月4日的《自然》新聞特寫上

原文作者：Helen Shen

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