Detergent的性質及其在膜蛋白中的應用

查看水通道相關蛋白和抗體

近年來，膜蛋白研究取得了明顯的進展，這離不開研究膜蛋白的相關工具和試劑的進步[1]。其中，去垢劑在膜蛋白的提取、純化和操作中起了重要作用。它們的兩親性質（amphiphilic nature）使得它們可以和疏水的膜蛋白相互作用，從天然脂雙層中提取並溶解膜蛋白。但是溶解不意味著可以完全恢復蛋白的天然結構和穩定性；同時可以有效提取膜蛋白的去垢劑也可能不適宜純化和進一步的生物化學研究；並且適用於某種膜蛋白的去垢劑也可能不適用於另一種膜蛋白。總之，在研究膜蛋白時，沒有一套標準可以預估某一個去垢劑一定合適。本文介紹去垢劑的物理和化學性質，以及去垢劑在膜蛋白處理中的應用。希望通過我們的介紹，可以幫助您選擇合適的去垢劑。

1.去垢劑的結構

去垢劑屬於表面活性劑，應用廣泛，包括：聚丙烯醯胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）、包涵體的溶解、脂質體的製備、膜蛋白溶解和活性結構研究等。並且，去垢劑在體外研究中也可以作為模型膜。

去垢劑的功能與其結構有關：去垢劑分子的極性親水部分被作為親水頭部基團（hydrophilic head group），而非極性疏水部分被作為尾巴（tail）（Figure 1A）。也有一些去垢劑是豆狀分子形狀(Figure 1B)，它們有極性和非極性的面，包括bile acid derivatives，例如CHAPS和CHAPSO。

Figure 1.A detergent monomer

2.去垢劑的分類

根據去垢劑親水基團的不同可以將去垢劑分為離子型（陽離子or陰離子）、非離子型和兩性離子型。

離子型去垢劑包括十二烷基硫酸鈉（SDS）、N-月桂基肌氨酸(N-lauryl sarcosine)、CTAB等，能從膜中有效地提取蛋白。這些去垢劑能有效地破壞分子內和分子間蛋白之間的相互作用，性質苛刻，傾向於將蛋白變性。其中，膽酸鹽類（Bile acid salts），例如膽酸鈉(sodium cholate)和脫氧膽酸(deoxycholic acid)，也是離子型去垢劑，但它們的骨架由剛性類固醇組成，比直鏈離子去垢劑更溫和。

非離子型去垢劑包括麥芽糖苷（maltosides）、葡萄糖苷（glucosides）和聚氧乙烯二醇（polyoxyethylene glycols），特點是親水頭部基團不帶電荷。這些去垢劑溫和、非變性，破壞蛋白-脂質和脂質-脂質相互作用。

兩性離子去垢劑包括Zwittergents，Fos-Cholines，CHAPS/CHAPSO等，親水頭部基團包含正負電荷。這些去垢劑像非離子型去垢劑一樣是電中性的，但通常能像離子型去垢劑一樣破壞蛋白之間相互作用，因此溫和程度介於中間。大部分成功的膜蛋白NMR研究利用的兩性去垢劑，例如Fos-Choline 12。

3.關於去垢劑的幾個概念

3.1臨界膠束濃度（The critical micelle concentration，CMC）

當考慮去垢劑應用時，膠束化是一個關鍵現象。每一種去垢劑都有一個CMC值，當去垢劑濃度高於CMC時，單體自組裝成非共價聚集體，也叫膠束micelles。膠束化實際上不在一個單一濃度內發生，而是在一個窄的濃度範圍內發生。

當作用於膜蛋白時，一個經驗法則是：去垢劑的工作濃度至少是2xCMC，而去垢劑:蛋白的重量比至少是4:1。當從原始膜中溶解膜蛋白時，去垢劑的工作濃度遠高於CMC，並且去垢劑與脂質的摩爾比是10:1。因此CMC決定了需要向各種蛋白和膜製品中加入去垢劑的量[2]。

去垢劑的CMC值並不是固定的，它會隨著溶液中pH，離子強度和溫度的改變發生變化[3]。例如離子型去垢劑的CMC會隨著溶液中離子強度的增加而降低。

3.2膠束化（Micellization）

膠束是溶液中去垢劑單體的聚集體，形成膠束的過程被稱為膠束化[4]。去垢劑以膠束的形式與膜蛋白和膜相互作用，蛋白的溶解依賴於溶液中膠束的形成。膠束通常被認為有著「粗糙」的表面，是動態的結構。膠束內的去垢劑單體與溶液中遊離的去垢劑單體快速交換。膜蛋白一旦被溶解，我們通常認為去垢劑分子在疏水跨膜域周圍形成環面。

4.去垢劑在膜蛋白中的應用

4.1去垢劑的替換或去除

可以有效溶解膜蛋白的去垢劑也可能不適宜做進一步的生物化學研究，這個時候需要將膜蛋白轉移到一個更合適的去垢劑溶液中。當組裝liposomes或nanodiscs時，需要去除去垢劑。當考慮替換或去除不需要的去垢劑時，CMC用來確定可用的方法。高CMC的去垢劑易通過透析除去，去垢劑溶液能通過透析稀釋到CMC值以下，此時膠束分解為單體，單體能容易地穿過透析膜。一般情況下，去垢劑溶液用超過200倍體積的不含去垢劑的緩衝透析幾天，中間幾次換液，例如Fos-Choline 12。低CMC去垢劑一般通過疏水珠吸附除去，例如DDM。還可以通過鎳柱純化，當膜蛋白結合到柱材料後，換含有另一種去垢劑溶液的緩衝即可。

4.2膜蛋白的鑒定

SDS-PAGE跑膠鑒定膜蛋白時，煮沸處理可能會導致膜蛋白的聚集。可以在室溫孵育10min，再直接跑膠。膜蛋白通常不會遷移在SDS-PAGE上預測分子量的位置處。它們一般會遷移得快一些（也就是看起來較小），這可能是因為摺疊得不完全或者每個分子量單位比水溶性蛋白結合了更多的SDS的原因[5]。

5.膜蛋白的表達

剛剛介紹了關於去垢劑的基本性質，但實際上製備膜蛋白是非常困難的。大部分的膜蛋白不能從天然環境中足量獲得，需要嘗試過度表達。不幸的是，通過大腸或其他系統，很難獲得足量的有功能性且穩定的膜蛋白。通常，跨膜次數越高的膜蛋白越難表達，例如包含6次跨膜域的水通道蛋白。

5.1水通道蛋白

水通道蛋白，是一種位於細胞膜上的6次跨膜蛋白質，在細胞膜上組成「孔道」，可控制水在細胞的進出。水分子經過水通道蛋白時會形成單一縱列，進入彎曲狹窄的通道內，內部的偶極力與極性會幫助水分子旋轉，以適當角度穿越狹窄的通道。

水通道蛋白主要大量存在於哺乳動物的腎臟，也存在於植物中。水通道在腎臟尿濃縮、消化生理、神經生理、呼吸生理、眼球生理和皮膚生理等中都有作用。

5.2水通道活性蛋白

Cusabio採用大腸無細胞蛋白表達技術。該技術不受細胞結構的限制，適於表達對細胞有毒害作用的膜蛋白和毒性蛋白，產量高達mg/ml。按照基於細胞的傳統表達方式，常規處理膜蛋白需要破壞細胞膜，這往往會引起插入其內的膜蛋白的構象變化甚至變性。而大腸無細胞開放的無細胞體系，可以體外多途徑優化表達產量，並且在表達中，表達的膜蛋白可以在翻譯後立馬被去垢劑包裹，最大限度的避免暴露在水溶液中。現已開發以下活性水通道蛋白。

5.2.1Recombinant Escherichia coli Aquaporin Z (aqpZ)

Function: Channel that permits osmotically driven movement of water in both directions. It is involved in the osmoregulation and in the maintenance of cell turgor during volume expansion in rapidly growing cells. It mediates rapid entry or exit of water in response to abrupt changes in osmolarity.

Fig 2.aqpZ in detergent micelles

Figure 3. The binding activity of aqpZ with ytfE.

Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized aqpZ at 5 μg/ml can bind human ytfE. The EC50 of human ytfE protein is 197.90-259.70 μg/ml.

查看水通道相關蛋白和抗體

下期內容《Nanodiscs在膜蛋白中的應用》

References

[1] R.M. Garavito, S. Ferguson-Miller, Detergents as tools in membrane biochemistry, J. Biol. Chem. 276 (2001) 32403–32406.

[2] Anatrace, Detergents and Their Uses in Membrane Protein Science.

[3] M. le Maire, P. Champeil, J.V. Mbller, Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents, Biochim. Biophys.Acta 1508 (2000) 86–111.

[4] From Wikipedia, the free encyclopedia.

[5] Purifying Challenging Proteins Principles and Methods, 28-9095-31.