項目文章 | CRY1與BES1互作調控BR信號及光形態建成

基本信息

論文題目： Photoexcited CRYPTOCHROME 1 Interacts with Dephosphorylated BES1 to Regulate Brassinosteroid Signaling and Photomorphogenesis in Arabidopsis

發表期刊：Plant Cell

發表時間：2018.8

影響因子：8.228

作者單位：復旦大學楊洪全教授課題組

本文涉及的高通量技術：酵母雙雜交篩庫（由歐易生物提供服務）

研究背景

光是最重要的環境因子，不僅是植物光合作用的能量來源，也是調控植物生長發育的信號來源。植物通過內在感應光的信號分子——光受體介導的信號轉導途徑來調控植物的生長發育。這些受體包括紫外光B受體UVR8、藍光受體隱花素CRY和向光素PHOT、紅光/遠紅光受體光敏素phy。在擬南芥中，CRY1和CRY2調控光形態建成、開花時間和生物鐘。近年來有研究表明，以油菜素內酯（BR）為代表的甾醇類激素廣泛參與植物光形態建成，但其作用機理並不清楚。

研究內容

作者發現，CRY1和CRY2能夠與bHLH轉錄因子BES1-INTERACTING MYC-LIKE1 (BIM1)相互作用。而BIM能與BRI1-EMS SUPPRESSOR1 (BES1)互作並激活其活性，從而參與BR信號通路。進一步研究發現，CRY1和CRY2特異與去磷酸化的BES1互作。這種活性狀態的BES1依賴藍光處理並經由BR誘導。CRY1-BES1的互作能夠抑制BES1結合DNA的活性以及下游靶基因的表達。以上結果表明，在藍光條件下，BR誘導CRY1與BES1互作，並通過此機制平衡外部光照與內部BR信號，進而優化植物的光形態建成。

研究思路

研究結果

1. 利用CRY1的N端（CNT1）作為誘餌蛋白進行酵母雙雜交篩庫，篩選到互作蛋白BIM1。進一步通過酵母雙雜交證明，CNT1與BIM1在暗培養以及藍光處理下都能互作，而CRY1的C端CCT1隻能與COP1互作。另外，在藍光處理下，CRY2及其N端CNT2也能與BIM1互作。作者另外通過pull-down證明，CNT1，CNT2和CCT2都能與BIM1互作。而在體內試驗環節，作者採用共定位和BiFC技術證實，CNT1對於CRY1和BIM1的互作至關重要；將GST-BIM1與植物蛋白提取物孵育，發現BIM1隻能與來自藍光處理植株的CRY1互作，與暗處理或紅光，遠紅光處理植物的CRY1不能互作。以上結果表明，CRY1與BIM1的互作依賴藍光的存在。

已知BIM1能與BES1互作調控BR下游基因的表達，因此作者進一步通過酵母雙雜交驗證CRY1與BES1（及其同源蛋白BRZ1）的關係。結果表明，CRY1與BES1在藍光處理下的互作強度高於暗處理條件， 而CRY1與BRZ1的互作不依賴藍光。pull-down實驗證明，BES1能夠與CNT1, CNT2，CCT2互作，但不能與CCT1互作。以上結果表明，CNT1對CRY1和BES1的互作至關重要，而CNT2和CCT2都能介導CRY1和BES1的互作。作者另外通過煙草Co-IP和BiFC驗證了上述結果。接下來，作者通過擬南芥轉基因植株，在體內證實了CRY1和CRY2能夠在藍光處理下與BES1互作。

2. 有文獻報道，芸苔素和BRZ能分別誘導BES1的去磷酸化和磷酸化。利用上述兩種物質處理BES1過量表達植株並進行Co-IP，表明光誘導的CRY1和CRY2隻能與去磷酸化的BES1互作。作者進一步通過pull-down證實了，CNT1, CNT2，CCT2能夠與去磷酸化的BES1互作。

3. 在藍光處理下，植株對芸苔素的響應沒有暗處理植株敏感，說明藍光能夠抑制BR信號轉導。利用高強度藍光處理CRY1突變體，其對BL濃度的響應比野生型更積極，而CRY1過量表達植株對BL濃度不敏感；低強度藍光處理下，cry1，cry2和cry1 cry2突變體對BL濃度比野生型更加敏感。以上結果表明， CRY1和CRY2介導了藍光對BR信號的抑制作用。

4. BES1-RNAi 植株在黑暗，藍光，紅光，遠紅光處理中，下胚軸長度都比野生型短；而BES1過量表達植株經過藍光處理， 下胚軸長度比野生型增長。這個結果說明， BES1能夠促進下胚軸的伸長。藍光處理（高強度和低強度）cry1 cry2 BES1-RNAi植株，其下胚軸長度都比cry1 cry2雙突變體更短。以上結果表明，在藍光處理下，BES1 和 BZR1作為CRY1和CRY2的下游調控下胚軸伸長。

5. 分析已發表的轉錄組數據，共篩選到629個CRY介導的藍光信號通路和BR信號通路共同調控的基因，其中381個基因具有相反的表達模式。GO分析表明，受到芸苔素的正調控和藍光信號的負調控的基因，主要涉及植物激素，細胞壁發育等方面；而芸苔素負調控和藍光正調控的基因，主要參與細胞壁發育和光合作用。進一步比較了藍光信號和BES1共同調控的593個基因，其中368個具有相反的表達模式。作者選擇了6個BR響應基因做定量PCR驗證，結果表明CRY1能響應藍光信號，調控BES1/BRZ1下游基因的表達。

6. EMSA實驗表明，BES1能夠結合BR信號marker基因DWF4的啟動子。體系中增加CNT1的濃度，能顯著減弱BES1的結合能力，而CCT1沒有類似的抑制作用。體內實驗表明，藍光處理1小時即可顯著增加野生型植株中BES1結合DWF4和SAUR15的能力，而cry1突變體對藍光不敏感。以上結果表明，藍光誘導的CRY1與BES1的互作，能夠抑制BES1結合DNA的活性。

7. 總結：①在黑暗條件下，CRY1處於非激活狀態，不能與去磷酸化的BES1互作。因此BES1可以誘導靶基因表達，參與下胚軸的伸長；②在光照條件下，CRY1轉變為激活狀態，與去磷酸化的BES1互作，從而抑制其結合DNA的活性；而當BR缺失時，大部分BES1被磷酸化失去活性，不能與CRY1互作。同時，下游靶基因也受到抑制，阻礙下胚軸的伸長。

總結

利用酵母雙雜交技術將光受體與BR信號通路串聯在一起，為解析光形態建成中信號交互的分子機制打開新思路。

參考文獻

Wenxiu Wang, Xuedan Lu, Ling Li, Hong-Li Lian, Zhi-Lei Mao, Peng-Bo Xu, Tongtong Guo, Feng Xu, Sha-Sha Du, Xiao-Li Cao, Sheng Wang, Hongyun Shen, Hong-Quan Yang. (2018). Photoexcited CRYPTOCHROME 1 Interacts with Dephosphorylated BES1 to Regulate Brassinosteroid Signaling and Photomorphogenesis in Arabidopsis. The Plant Cell Aug 2018, tpc.00994.2017; DOI: 10.1105/tpc.17.00994

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西貝老師 撰文

本文系歐易生物原創

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