體外診斷專題（二）——技術脈絡和研發進展

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本期將為您系統梳理體外診斷的技術發展脈絡和分類，並著重介紹免疫診斷、分子診斷領域比較重要的幾類技術，供您做研究分析時查閱參考。

一、IVD產品的生產技術分類

1.1 IVD產品生產技術的發展路徑

整體而言，體外診斷技術的發展經歷了三個時期。上世界中葉之前，一直處於實驗生物學時期，體外診斷的技術非常傳統，檢驗範圍有限；50年代以後，免疫診斷開始發展，分子診斷技術出現；2000年以後，免疫診斷技術不斷成熟完善，分子生物學技術廣泛應用到體外診斷領域中。

1.生化診斷

生化診斷產品不論在國內亦或海外都已熟透，技術壁壘低，面臨被其他更精確快速的診斷技術完全替代的風險，國內寡頭中生北控（http://8247.HK）、 科華生物、利德曼等對市場的壟斷力非常強勁。

2.免疫診斷

免疫診斷在海外發展了60多年，技術較成熟。與生化診斷不同，免疫技術和後來興起的分子技術體外核酸擴增技術（PCR）目前對同類疾病診斷的特異度和靈敏度幾乎平分秋色，所以近期被替代的風險小，主要是內部的技術升級換代——國外是寡頭邊壟斷著市場邊自我升級；國內則處於大洗牌期，跟不上國外寡頭升級節奏的就只能抱憾出局。

免疫診斷領域技術的發展經歷了多個階段。目前同位素放射免疫由於環境污染問題已基本被淘汰。根據2015年的市場數據分析，我國免疫診斷市場中，酶聯免疫佔據約60%的市場份額，化學發光佔據約40%的市場份額；而國外市場中，發光診斷的市場份額高達90%，佔據免疫診斷的主要市場份額。而化學發光集多項優點於一身，成為免疫診斷的主流方向，是IVD行業中的黃金細分領域。

3.分子診斷

目前在耐藥性治療和研究中，主要採用細菌培養方法及分子診斷方法做葯敏實驗。細菌培養方法耗時長，實驗結果需要2-5天甚至更長時間才能得出。分子診斷直接針對微生物DNA變化而做出檢測，實驗結果只需幾個小時，能快速發現微生物是否具有耐藥性。儘管腫瘤耐藥性的發生機制十分複雜，至今還未了解其本質，但是醫學界比較公認是，化療失敗主要與癌細胞對化療藥物具有或產生了耐藥性有關，現已發現多種與腫瘤多葯耐葯相關的分子或基因。因此，在腫瘤耐藥性的研究中，分子診斷具有不可替代的作用。

分子診斷是當代醫學發展的重要前沿領域之一，相比免疫診斷，優勢在於診斷結果更加精準，並且可以診斷遺傳性疾病。分子診斷的常規技術包括：（1）聚合酶鏈式反應（PCR）；（2）DNA測序（DNA sequencing）；（3）熒光原位雜交技術（FISH）；（4）DNA印跡技術（ DNA blotting ）；（5）單核苷酸多態性（SNP）；（6）連接酶鏈反應（LCR）；（7）基因晶元技術（gene chip）。其中，PCR產品佔據目前分子診斷的主要市場，基因晶元是分子診斷市場發展的主要趨勢。

PCR產品靈敏度高、特異性強、診斷窗口期短，可進行定性、定量檢測，廣泛用於肝炎、性病、肺感染性疾病、優生優育、遺傳病基因、腫瘤等，填補了早期免疫檢測窗口期的檢測空白，為早期診斷、早期治療、安全用血提供了有效的幫助。主流的PCR技術據說比當下主流免疫技術的壁壘低，國內市場處在「偽寡頭真紅海」的局面。

基因晶元是分子生物學、微電子、計算機等多學科結合的結晶，綜合了多種現代高精尖技術，被專家譽為診斷行業的終極產品。但其成本高、開發難度大，目前產品種類很少，只用於科研和藥物篩選等用途。

歷經20餘年發展，我國分子診斷歷程主要分三個階段：

第一階段：中國分子診斷行業發展始於20 世紀60年代，80年代出現核酸探針放射性核素標記、點雜交、Southern印跡雜交和限制性片段長度多態性連鎖分析為代表技術的分子診斷技術。全國重點城市一些研究單位開始陸續建立了地中海貧血、苯丙酮酸尿症、血友病、杜興氏肌營養不良、紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏症（G-6-PD缺乏症）等幾個常見遺傳病的分子診斷方法。

第二階段：20世紀90年代，由於PCR技術的推廣應用，分子診斷技術在中國得到了較快發展，開始進入臨床實驗室。除單基因遺傳病外，腫瘤、感染性疾病、基因多態性、多基因遺傳病等也被納入分子診斷的範圍，幾乎所有的實驗方法都建立在PCR技術的基礎上。

第三階段：90年代後期以來，伴隨著人類基因組計劃的啟動(1994 年)以及中國正式參與國際人類基因組計劃(1999年)，分子診斷開始從關注單個基因轉向關注整個人類基因組。而受益於PCR熒光技術應用及基因晶元技術的開發和推廣，尤其是高通量DNA測序技術的突破性進展，我國分子診斷行業開始步入高速成長階段。

1.2 主要的免疫診斷技術簡介

1.免疫診斷的幾類技術

（1）膠體金法

膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用於定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。

用還原法可以方便地從氯金酸製備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合，因而在基礎研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。

膠體金法是非常成熟的技術，廣泛用於肝炎、艾滋病、早孕等檢驗試劑產品。

（2）酶聯免疫（ELISA）

酶聯免疫（ELISA）是讓抗體與酶複合物結合，既保留抗體免疫活性，又保留酶的活性，然後通過顯色來檢測。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體複合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

ELISA也是非常成熟的技術，已被廣泛應用於多種細菌和病毒等疾病的診斷。在動物和食品檢疫方面，ELISA在豬傳染性胃腸炎、牛副結核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍舌病等的診斷中已為廣泛採用的標準方法。

（3）化學發光法

化學發光免疫法（Chemi Luminescence，簡稱為CL）是分子發光光譜分析法中的一類。化學發光是伴隨化學反應過程所產生的光的發射現象，當某些物質在化學反應時吸收了反應過程中的化學能，使反應的產物分子或反應的中間態分子中的電子躍遷到激發態，當電子從激發態回復到穩定的基態時，多餘的能量以發射光子的形式釋放出出來，這一現象稱為化學發光。

化學發光免疫將具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，用於各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術。該技術通常由參與催化某種化學發光反應的酶（如HRP或ALP）來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應的抗原(抗體)發生免疫反應後，形成固相包被抗體‐待測抗原‐酶標記抗體複合物，經洗滌後，加入相應底物(發光劑)，由酶催化和分解底物發光，由光量子閱讀系統接收，光電倍增管將光信號轉變為電信號並加以放大，再把它們傳送至計算機數據處理系統，計算出測定物的濃度。

綜上而言，不同的免疫學診斷方法，有其不同的特點和應用場景，具體比較如下：

2.分子診斷的幾類技術

（1）聚合酶鏈式反應（PCR）技術

聚合酶鏈式反應是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA複製。PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛髮、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留複製鏈。

（2）基因晶元技術

簡單的講，基因晶元就是按照預定位置固定在固相載體上很小面積內千萬個核酸分子所組成的微點陣陣列，在一定條件下，載體上的核酸分子可以與來自樣品的序列互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核算片段進行標記，在專用的晶元閱讀儀上就可以檢測到雜交信號。

基因晶元技術國外市場美國illumina公司一家獨大。在SNP晶元研究領域，美國illumina公司毫無疑問是霸主，illumina公司憑藉自己開發的GoldenGate技術和infinium專利技術一直在SNP晶元領域處於壟斷地位。illumina的全基因組表達譜晶元是目前唯一一種可以達到探針30倍重複的表達譜晶元，其他的晶元都只能達到1-8倍技術重複。因此illumina的全基因組表達譜晶元的重複性是所有晶元中最高的，其重複性R2＞0.996，並且基於第三代基因晶元獨特的微珠晶元生產工藝，晶元生產成本較低，信噪比和靈敏度都非常高，其靈敏度≤1:250,000，晶元檢測結果和qPCR相關係數R2=0.97。因為illumina所佔的市場份額越來越多，2012年6月另一基因晶元大廠家Nimblegen公司，正式宣布退出基因晶元市場。

國內基因晶元製造水平低，相關的企業規模小、投入也少，遠達不到國外的水平。所以國內的相關公司均以引進國外基因晶元，提供檢測服務為主。不過，隨著基因晶元的應用推廣，一些公司也開始涉足基因晶元製造。上市公司達安基因，業務以體外診斷為主，產品主要是試劑盒，但也開始涉足基因晶元製造。而另一以基因檢測服務著稱的大企業華大基因，則通過收購國外公司進入基因晶元製造領域。美國上市公司Complete Genomics 公司有自己基因晶元和晶元檢測設備。但該公司2011年的業績只有2000多萬美元，其基因測序服務成長大大低於預期，股票跌破發行價，最後被中國華大基因收購。聯川生物在microRNA晶元領域也小有名氣，也是唯一一家國產的microRNA晶元，該晶元最大的特點就是更新速度極快，一般新的資料庫發表後，第一個將晶元更新到最新版本的就是聯川生物。illumina公司於2010年退出了microRNA晶元市場，因illumina公司2006年收購了高通量測序領域NO.1的Solexa公司，成為唯一一家即擁有晶元平台又擁有高通量測序平台的供應商，illumina認為在microRNA領域，高通量測序有不可比擬的技術優勢，必然會取代晶元，所以於2010年停產了microRNA晶元。

生物晶元技術正逐漸成為分子診斷的主流技術和未來發展方向，在我國尚處於發展初期，國內生物晶元技術與國外有一定差距，國內僅有少數幾家企業具備進入該領域的實力。

參考文獻：

1.透景生命、凱普生物、安圖生物、基蛋生物招股說明書；

2.《價值再發現,不一樣的 IVD——體外診斷行業深度報告》，興業證券研究所。

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