7 年分子克隆經驗總結

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● 如果是雙酶切 A 和 B，預實驗中必須做 A 和 B 各自的單酶切和 A+B 的雙酶切, 好確認這幾種酶都好用，質粒上的切點都好用。如果切不開就要考慮是不是酶的問題，buffer 的問題，質粒上有沒有這些切點，序列是否甲基化等。

● 酶切盡量用大體系，如 50ul、100ul 等。大體系能稀釋內切酶包裝中的甘油，對反應有利。相反，連接盡量用小體系，以增加 DNA 末端的碰撞機會。

● 如果要回收、連接，酶切用的 DNA 量不用太大。大了會切碎，形成一些不規則的末端，不利於連接。

● 酶切後的電泳，即切膠的那次電泳中，如果切成的條帶很清晰，不拖泥帶水，沒有彌散，沒有拖尾，那做回收、連接效果最好。相反，若有彌散、拖尾、不清楚、一團亮等情況就是切的不好，做後續實驗成功率會降低。若真是效果很差建議改進體系重新切。

回收

回收可以用柱式試劑盒或手工法。柱式回收試劑盒：此類試劑盒適合各種長度 DNA，對黏性末端基本沒有破壞，回收效率也不錯。手工醇沉澱法步驟如下，把切得的膠弄碎，用 Tris-HCl 浸泡一段時間，吸出所有的液體，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加鹽和醇醇沉，沉澱用 70％ 乙醇漂洗，再用 Tris 溶解。次方法優點是對 DNA 和黏性末端的損傷最小，缺點是容易損失 DNA。若本來 DNA 數量就不多，用手工法很容易丟失殆盡；如果 DNA 量很大可以考慮使用。

回收後要電泳，一來估算回收液濃度，二來看回收 DNA 的質量。若條帶有彌散，即自目的條帶以下有拖痕，不是清晰利落的一條帶，則質量不好。因為條帶拖痕表示它已碎裂成比它小的各種長度的片段，而主帶雖然還在那個位置但也已遭到一定程度的破壞。質量不好的回收產物做連接成功率會降低，假陽性克隆會增加。造成回收質量差的原因可能是回收這步，也可能是酶切那步，如果酶切那步出現酶切中所描述的情況，就容易造成回收質量不好。只有回收到清晰、利索的條帶，才不影響連接。

感受態

做連接要求感受態的效率要高。感受態的感受效率一般剛製備完時是最高的，以後逐漸減弱，而且每次開－80℃ 冰箱溫度微升對感受態效率都有一定影響，久而久之效率就不行了，這就要求大家取感受態時動作迅速、最大程度減少感受態盒升溫。都知道感受態效率高好，但麻煩的是感受態效率的高低不好通過實驗來檢測，因為若通過轉質粒來檢測，只要是效率中等的感受態都能長出很多克隆。所以如果你們的感受態已經儲存了很長時間或者連接長的克隆連續幾把都太少就要重做感受態了。製備感受態不推薦新手直接去做，最好由經驗豐富者做或他帶你做。用新做的感受態轉質粒，用同樣手法用量，你會發現比舊感受態明顯多長很多克隆。

連接

最後才輪到連接。連接的問題討論的是比較多的。如果前述若干步驟所得產物質量好，連接不會很難。

DNA 的量：DNA 總量有幾十 ng 就能連接成。當然如果你的 DNA 質量好，DNA 用量越大連接效率越高。就怕你為了追求 DNA 數量而降低了質量，那可就得不償失了。

vector 和 insert 的比例：如果 insert 不長（2 kb 以下）、vector 是 insert 的幾倍長，可以用 1：3－1：9。如果 insert 較長（3-4 kb 以上）、vector 和 insert 長度相似或 insert 比 vector 還長，可以用 1：1－1：3。短片段的連接相對容易，做的好可以挑到好多正確的克隆。長片段的連接效率較低，陽性克隆率小於等於 10％ 是很正常的。我做過一個長片斷的連接，6k 的 vector、6k 的 insert，比例用 1：1，挑了 20 個克隆有一個對。

● 體系體積：通常用 20 ul 都能連上，若連長片段可以壓縮成 10 ul（前提是 DNA 數量不變）。我覺得體系不是很關鍵，有位很精通克隆的老師說他都用 50 ul 體系，照樣百發百中。而且如果你的 DNA 是用 EB（即 Tris）溶解的，體系中不加水也行。前述我自己連的長片段也是用 20 ul 體系，vector 和 insert 各上 8 ul。

● T4 連接酶：酶這東西自然是越貴越好，一分錢一分貨，而且連接酶控制著整個分子克隆過程的瓶頸——連接，強烈建議買好的。我用過 Promega 的，還好；BBI 的湊合用。如果連長片段就加二倍的連接酶。

● 連接時間：過夜就應該足夠了，但是你要是不急著轉化，放到 4 度放幾天也行，我個人認為時間長只好不壞。

● 連接溫度：最適是 16℃。有人用 PCR 儀造 16℃，我用泡沫冰盒加涼水再添冰，用手感覺差不多十四五六度，然後蓋蓋過夜，基本上溫度不太變。你若感覺好不溫度，拿個溫度計測也行。有人用 4 度連接，也行，我有時先 16 度過夜，再放 4 度里幾天。

● 轉化：連接的轉化不能像轉質粒那麼隨便，要小心翼翼，盡量作到不放棄任何一個菌。一般所用的感受態體積最少是連接體系的 5 倍。長片段的連接轉化時搖菌 2 小時。

● 對照：對照很關鍵，可以反應出很多重要的信息，不要懶，你的連接若是問題不少，就要乖乖的做對照。一般有如下幾種對照方式：

● 轉化質粒對照。和連接產物同樣抗性、一起轉化、塗在同一個板上。這個對照目的是檢測轉化系統是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、轉化的手法是否正確、以及感受態的效率如何（這需要你每次轉化質粒都用相同的手法、用量，看長的菌落數，若明顯太少就要懷疑感受態）。還有一個作用，如果質粒早就長出來了，都長挺大了你的連接產物還沒動靜呢，那八成是沒戲了，別等了趕快去準備下次連接的材料吧。

● 切完回收的 vector 直接轉化對照。如果你是雙酶切，切完的 vector 和沒切的 vector 的長度相差不大，或跑電泳這兩種跑不很開，就要做這個對照。目的是看切的是否徹底，是否還有環狀質粒存在。長不出克隆是對的，若長出克隆，好好改進你的酶切系統吧。

切完回收的 vector 加連接酶自身連接再轉化做對照。雙酶切的，最好要做這個對照，而且這個對照長的克隆要挑若干提質粒。一、若切完的目的 vector 和沒切的 vector 的長度相差較大，電泳條帶離的遠，這個對照能檢測酶切和回收的質量。如果 DNA 末端遭破壞或斷裂，會隨機產生各種末端，這些末端少數能連接到一起，長度上小於等於回收的 vector。二、若切完的 vector 和沒切的 vector 的長度相差不大，這個對照除了檢測「一」中所說的還檢測是否有隻進行了單酶切的。總之不長克隆或只長很少是對的，長多了還是去改進上游的步驟吧。