熒光定量 PCR 疑難解析大本營（一）

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聚合酶鏈式反應 (PCR) 是分子生物學領域功能最強大的技術之一。實時熒光定量PCR 是在標準 PCR 技術基礎上演變而成，常用於定量樣本中的 DNA 或RNA。

利用熒光探針或熒光 DNA 結合染料，採用實時熒光定量PCR 儀檢測熒光並完成 PCR 反應所需的熱循環，實現擴增產物的定量。利用序列特異性引物，可測定特定的 DNA 或 RNA 序列的拷貝數。通過檢測 PCR 循環的每個階段中擴增產物的量，實現定量。如果樣本中存在高丰度的特定序列 (DNA 或 RNA)，則在早期循環中即可觀察到擴增；如果序列較少，則在晚期循環中方可觀察到擴增。

實時熒光定量 PCR 分析的部分實施需要經過優化以確保所有反應參數均設置精確，從而獲得準確的結果，常見困難可歸結為六個主要方面，今天重點介紹前三種：

一、引物二聚體的形成

1、引物二聚體形成的原因

引物二聚體的形成是在實時熒光定量 PCR 設計和驗證過程中最常見的問題之一，當引物對之間的部分序列存在同源性時，可形成引物二聚體。如果在 PCR 反應過程中引物退火形成二聚體，則 TaqDNA 聚合酶可延伸二聚體，形成長於原始引物的產物，它可導致循環過程中更易出現退火錯誤。根據長度的不同，引物也可能出現自身摺疊，由此與模板形成衝突。反應的複雜性 (尤其在多重反應過程中) 可使上述不良影響發生的幾率增加。

2、如何確定是否存在引物二聚體？

凝膠電泳是顯示引物二聚體的一種極佳的方法。如圖 1所示，引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位100 bp 以下。在 PCR 過程中，二聚體的形成與模板的退火及延伸之間存在競爭作用。引物二聚體通常隨模板的減少而增加。單獨採用凝膠電泳分析進行驗證的缺點在於，其靈敏度最低僅達到納克級，因此可能無法得出結果。凝膠電泳分析的優勢是當解離曲線 (熔解曲線) 數據同時可用時，產物的大小有助於對結果進行綜合解釋。

圖1

解離曲線，又稱熔解曲線，是利用雙鏈 DNA 結合染料獲得的標準反應熱廊線。如果擴增具有極好的特異性，則實時熒光定量 PCR 板上每個反應孔的解離曲線將出現一個較窄的單峰。引物二聚體的熒光強度較低，呈較寬的「波形」，顯示其在 70°C 左右熔解。出現此峰形和熔解溫度主要是由於引物二聚體的長度較小且不確定。若對解離曲線中是否存在引物二聚體有任何疑問，可將觀察的結果與 NTC（No Template Control，即無模板對照，是陰性對照）反應孔相比較，當模板不存在時，更易出現引物二聚體峰 (圖 2，熔解曲線中突出顯示了特異性擴增 (圖2A) 和引物二聚體效應(圖2B)。可利用 NTC 樣本在熔解曲線中產生多餘的峰(圖2B) 識別出引物二聚體)。

圖2

3、如何減少或去除引物二聚體？

如果出現了引物二聚體，有許多方法可以減少或消除反應中的引物二聚體。

（1） 首先是優化熱循環條件，這主要是提高退火溫度。大多數情況下，兩步循環 (由 95°C 變性步驟直接進入60°C 退火和延伸步驟) 有利於強效擴增，因此引物設計時設定的成功退火溫度為 60°C。

（2）可降低引物濃度，甚至採用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數情況下，每條引物的理想最終濃度為 200 nM，但如有需要，可將濃度降至 60 nM。

（3）鎂的最佳濃度一般約為 3 mM。高於此濃度易形成引物二聚體。

（4）如果未對引物形成二聚體的傾向進行評估，則應補充評估並考慮重新設計 (如有需要)。通常情況下，最好使用熱啟動 DNA 聚合酶，並在冰上進行反應。

（5）在理論上，針對同一靶點應同時檢測多個引物組。這實際上可以節省大量時間，因為如果這些引物中的一個能立即發揮作用，則可以減少花費在優化過程上的時間。

二、引物和探針的儲存

1、引物和探針的儲存

儘管引物和探針的儲存經常被忽略，但其在保證實時熒光定量 PCR 分析的長期成功和一致性方面具有重要作用。影響引物和探針的穩定性的主要因素是儲存溫度、儲存時間、是否被長時間暴光、儲存的引物和探針的濃度以及儲存溶液的組分。圖3擴增曲線分別顯示了儲存不當的引物 (A) 與儲存適當的引物 (B) 產生的效果。

圖3

2、長期保持引物和探針的穩定性保持引物和探針的穩定性的關鍵有四點：

（1）低壓凍乾的引物在儲存時間和溫度方面具有更好的靈活性。引物一旦重新溶解，即應置於 -20°C 保存，且若保存時間超過一年則應對其進行監測，看它是否出現功能下降。

（2）對於標記的引物和探針，則應採取措施避免標記物暴光 (例如使用不透明管及置於暗處保存)，以延長它們的使用壽命。

（3）引物濃度也可影響其穩定性。建議引物的儲存濃度不低於10 μM；實際上，在大多數情況下，100 μM 的引物濃度操作更簡單。引物和探針還應分裝保存，以減少凍融次數，特別是標記的引物和探針。

（4）最後，TE 緩衝液可形成比水更為穩定的環境。此外，含有 0.1 mM EDTA的 TE 緩衝液 (標準 TE 中含有 1 mM EDTA) 是一種理想的溶液，這是由於一些 PCR 反應對 EDTA 的靈敏度可能有一些殘存。

三、NTC 擴增

如前所述，當引物二聚體形成時，如果使用與 DNA 雙鏈結合的染料，在 NTC 反應中也可觀察到熒光信號。無論是基於探針還是雙鏈 DNA 結合染料的反應，在存在污染物的情況下，也可看到晚期擴增。見圖4，A是擴增曲線B是溶解曲線。

如果在每一個 NTC 反應里都出現擴增，很可能是其中一種或兩種試劑被污染了。可採用以下步驟防止或去除污染。

（1）使用乾淨的工作台，用帶核酸降解試劑的的溶液擦抹工作檯面。

（2） 用帶 dUTP 和 UDG 的反應預混液降解來自前序 PCR反應的產物，防止前序 PCR 反應的污染。

（3） 用新的反應管通過置換不同來源的試劑，發現出現問題的試劑。

（4） 在條件允許的情況下，在不同的實驗地點建立反應，尤其是當應用質粒作為對照時 (質粒可以被很容易擴散並且難以去掉)。

圖4

優化實時熒光定量 PCR 反應過程需要花費一定的時間，但是所花的時間是值得的。這樣得出的分析結果不僅具有最高的靈敏度和最大的動態範圍，而且效率高，重複性好。這些因素使數據具有可靠性，並最終為研究界所接受。

來源：醫學方