載體構建中片段的連接

08-21

載體構建中片段的連接

來自專欄生物科研

1. 兩片段連接

通常是指目的片斷和載體片斷的連接，包括①小片段（目的片斷小於載體片斷的大小）和載體片段的連接，這種情況多些，也比較容易連接，按照說明書要求的比例進行即可，比如TAKARA的pMD19-T Simple Vector連接時Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為1 ：2～10即可，如果效果不佳，檢測一下感受態細胞，如果片斷過小比如幾十bp，連接時要加大小片段的摩爾數，多連幾管，挑選白斑，以上是指雙酶切後的連接，即載體和目的片斷倆端的酶切位點相同；②大片段（目的片斷與載體片斷的大小差不多甚至大於載體的大小）和載體片段的連接，目的片斷與載體片斷的大小差不多的情況應盡量避免，因為這會給目的片斷膠回收帶來麻煩，我就遇到過這種情況，膠回收時很是費盡，最後勉強分開，當然換個載體也許就解決問題了。我做過3000多bp和pMD19-T Simple Vector的連接，開始不行，後來成功了，連接率不高，我的經驗是如果感受態細胞沒問題，那就反覆試目的片斷和載體片斷的連接比例，可以超出此範圍1 ：2～10一試。

2. 多片斷的連接

做多個片斷的連接，首先強調一個問題，那就是一定要注意所有片斷倆端的酶，把他們的特徵要弄得清清楚楚，是否存在同尾酶和同裂酶，多片段同時連接時這個問題就太重要了；多片段連接要總體先規劃好了，再開始入手設計引物，否則考慮不周后患無窮啊！

①多片斷的連接最經常的做法是順次倆倆連接（目的片斷和載體片斷的連接），就採用載體上的多克隆位點，注意順序！如果所選載體多克隆位點上的倆個酶切位點比較近，甚至相鄰，最好分步酶切載體，比雙酶切效果好的多，經驗！接下來的方法和前面的差不多，就是麻煩些

②多片斷的同時連接，我最多做過四個片斷的同時的連接，當然，其中包括載體片斷。做多個片斷的同時連接，不得不把我走過的彎路告訴大家！那就是同尾酶的問題，我也是在合成引物後發現的這個問題，我的其中一個片斷倆端分別是XhoI和SalI，結果問題來了，酶切後連接時有可能正連也可能反向連接，如果連正了還好，反了就比較鬱悶了，根據當時的實驗設計，如果想改就得改所有其他片段的引物，硬著頭皮來吧！篩吧！一個原則，小片段要量大，多設計幾種比例，連吧，挑選白斑，做菌落PCR檢測連接情況，想想覺得痛苦，每個板挑幾十個白斑做鑒定，大部分假陽性，不過最後還是找到了正確連接的克隆，可是浪費了很多時間和金錢，慘痛的教訓！感覺多片斷的連接，關鍵還是片斷之間的摩爾比，大膽嘗試吧！