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【病毒學】第二節 病毒的研究方法

08-16
【病毒學】第二節 病毒的研究方法

病毒的研究方法

  1. 病毒的培養方法

病毒依賴活細胞繁殖，有培養病毒必須合適的活細胞和宿主系統。、

體外培養技術：二十世紀中期動物培養體外培養技術的建立，極大推動了動物病毒學研究的發展。

細胞培養技術在病毒學中的應用：

·病毒學生物定量

·病毒克隆——獲得遺傳均一的病毒

·方便地產生病毒

·同步化研究病毒複製的過程，提高實驗的重複性

  1. 病毒的定量

並不是所有的病毒顆粒都有感染活性—有的感染活性的病毒顆粒一般僅佔總數的幾百到幾萬分之一。

·因此病毒的定量分為：

——物理顆粒的數量

——有感染活性顆粒的數量

·後者更有生物學意義

——特稱為病毒的效價（Titer或Titre）

病毒效價的測定：

確定病毒的毒力最常用經典方法：TCID50，半數細胞培養物感染量；EID50，半數雞胚感染量，還有就是用動物測定LD50。

　一般如果做毒力檢測，最常用，也是最直接的就是做生物測定。

　間接測定的話，可以用ELISA、電泳、HPLC等各種方法進行毒素的測定，當然如果你確定病毒的毒力因子的話，也可以用PCR、Western進行檢測。

空斑測試（plaque assay）

·用稀釋的病毒液感染單層細胞。

·蓋上瓊脂，限制病毒的流動。

·病毒感染造成局部細胞死亡或者病變，形成肉眼可見的「斑」或「空斑」（噬菌體中：噬菌斑）

公式：

多孔板終點稀釋法：

·病毒逐級稀釋

·接入長有細胞的孔中

·培養後觀察各孔中細胞是否被感染

·計算TCID50—（Tissue Culture50% Infection Dose——一半的孔被感染時的稀釋度）

病毒效價的相對性：

·用不同的細胞株去測定病毒的效價，可能會得到完全不同的效價數據——需要標準化

病毒感染複數：

·病毒感染細胞時平均每個細胞的病毒數

2、活體培養病毒的方法

因為有許多的病毒還缺乏可供複製的離體細胞培養系統

——如：乙肝病毒、大多數植物病毒植物病毒

最近對乙肝病毒培養的方法

·活體系統還可以提供病毒與宿主相互作用的信息

——免疫反應

——致病機理

——治療方法

·最常用的活體系統之一:雞胚

雞胚用於繁殖病毒、製備疫苗

關於雞胚培養的一些東西：

雞胚培養和細胞培養_百度文庫?

wenku.baidu.com

·免疫缺陷動物（SCID小鼠）

——對病毒感染無免疫排斥

——可接入人的免疫細胞等，使之具有人的免疫功能，用於研究HIV、皰疹病毒等與免疫系統的相互關係

·轉基因動物：研究致病和治療的模型

——表達HIV基因的大鼠

——帶有乙肝病毒基因組的小鼠

——宿主基因剔除的小鼠（小鼠基因剔除原理:

打靶載體製備基因剔除小鼠採用什麼原理_360問答?

wenda.so.com

）

·替代病毒：研究動物病毒來認識相關的人類病毒

——鴨乙肝病毒：用作人乙肝病毒研究的模型

——鼠68型皰疹病毒的模型

二、病毒形態學的研究方法

  1. 光學顯微鏡

·病毒細小，一般光學顯微鏡下不可見

·但有時可見病毒聚集，或衍生的包涵體（—包涵體是外源基因在原核細胞中表達時，尤其在大腸桿菌中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區，與胞質中其他成分有明顯區別。）——狂犬病毒包涵體

  1. 電子顯微鏡

·病毒形態研究主要利用電子顯微鏡

·電鏡使人們認識到病毒並非「感染性液體」

·常用的電鏡方法：

——投射電鏡：電子束透過樣品，根據樣品的電子密度成像

——掃描電鏡：在樣品表面噴塗反射電子的金屬薄層，電子束打到樣品表面反射成像

·電子顯微鏡

·新的電鏡技術

冰凍電鏡、低輻射電鏡

X射線晶體學：通過X射線衍射研究病毒中原子、分子的排列。只能研究課形成晶體的病毒，對於有膜的病毒和一些結構複雜的病毒無能為力。

·熒光顯微鏡：新的熒光顯微鏡技術用於實時跟蹤AAAV入侵的過程

  1. 免疫學方法

·病毒學和免疫學是密切相關的

·免疫技術在病毒學中的應用——利用抗原抗體反應的專一性進行：

—病毒的假案側

—病毒的鑒定分型

—病毒的定量

—特異性抗體的監測

常用的免疫學技術：

·血球凝集試驗

·補體結合試驗

·酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

·免疫印跡試驗（Westernblot）

·免疫熒光組織化學

·免疫膠體金標記

·免疫共沉澱

免疫學方法的局限：

·常發生交叉反應、非特異性吸附

克服免疫學方法的局限：

·在實驗中必須設有嚴密的對照

·單克隆體技術的出現大大提高免疫學反應的專一性

關於單克隆體技術：

單克隆抗體技術_360百科?

baike.so.com圖標

  1. 生化、生物物理與分子生物學方法

·生物物理方法：

—離心技術

·病毒顆粒分離純化

·病毒顆粒的大小、沉降係數測定

·生物化學方法：

—病毒顆粒生物化學組分分析

·蛋白質分析

·核酸分析

·其他組分分析

分子生物學方法

·分子生物學方法：病毒學的主流技術

—基因、基因結構與功能分析

—基因組複製機制分析

—基因表達及調控分析

—蛋白質組成與結構分析

—········……

例子：

病毒反向遺傳學技術

反向遺傳學_360百科?

baike.so.com圖標

遺傳學：性狀→基因

反向遺傳學：基因→性狀

通過遺傳操作人為改變基因，分析功能變化，從而認識基因的功能

·人工合成脊髓灰質炎病毒

合成DNA片段，拼成脊髓灰質炎病毒基因組→克隆到表達載體，使可以在細胞中產生相應全長mRNA→質粒轉入細胞，產生完整的有感染力的病毒

問題：

  1. 如何理解病毒感染複數？

2．在用雞胚或者動物培養來看人類病毒，是不是會存在差異，導致對人類病毒把握不到位。、？

3、在人工合成病毒時存在對問題。


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