乙烯信號簡史 | 乙烯受體家族的「發家史」

來自專欄菜鳥學飛記

自從ETR1基因被成功克隆後，關於乙烯受體方面的研究就開始層出不窮。人們逐漸發現，乙烯受體並非「一枝獨秀」，而是由多個「兄弟」組成了一個受體家族。我們可以把ETR1比作乙烯受體家族創業的開拓者，它完成了最原始的積累，並帶領著其他成員一路開疆拓土，創建了顯赫的乙烯受體家族。下面就讓我們一起扒一扒乙烯受體家族的「發家史」吧。

在上一講中，我們曾經提到過，Elliot M. Meyerowitz實驗室1993年發表的克隆ETR1的Science文章中發現了一個非常有意思的現象：當用ETR1基因和擬南芥基因組DNA雜交時，可篩選到多條片段，說明ETR1可能存在一個基因家族。那麼這些基因是什麼，它們和乙烯信號轉導到底有什麼關係呢？在接下來的幾年裡，Elliot M. Meyerowitz實驗室對這一科學問題進行了深入細緻的研究。

1995年，Elliot M. Meyerowitz實驗室在Science上發表文章Ethylene insensitivity conferred by Arabidopsis ERS gene。他們以ETR1的cDNA為探針，對擬南芥基因組DNA文庫進行篩選，篩選到一個同源基因，命名為ERS（ethylene response sensor）。ERS定位在2號染色體上，編碼613個氨基酸，和ETR1蛋白具有67%的一致性（identity），但是比ETR1短了125個氨基酸。ERS的N端（1-321）和ETR1的相似性為75%，在蛋白質資料庫中沒發現已知結構域注釋；C端含有一個預測的組氨酸激酶結構域，和ETR1具有58%的相似性，但是少了一個receiver domain。值得注意的是，在對乙烯反應突變體的正向遺傳學篩選中，一共篩選到了4個ETR1等位突變（etr1-1至etr1-4），這4個突變位點分布在3個疏水結構域中，而在ERS中，這4個位點都是保守的。

雖然ERS和ETR1具有一定的相似性，但是它在乙烯信號轉導中發揮什麼作用呢？在etr1-4突變體中，ETR1蛋白第62的Ile被Phe替換，導致顯性的乙烯不敏感。既然這個位點在ERS中也是保守的，那麼ERS中發生相同的突變後，會發生什麼呢？科研人員利用定點突變的方法，將相同的突變引入ERS中，並轉化擬南芥。和etr1-4相同，轉化ers的擬南芥黃化苗也表現出顯性的乙烯不敏感表型，並且在其他生長時期同樣也都對乙烯不敏感。以上結果說明，ERS可能具有和ETR1類似的乙烯受體功能。

在對擬南芥乙烯反應突變體篩選的過程中，Elliot M. Meyerowitz課題組還篩選到了另外一個顯性的乙烯不敏感突變體etr2-1。1998年，相關研究成果以ETR2 is an ETR1-like gene involved in ethylene signaling in Arabidopsis為題發表在PNAS上。通過圖位克隆，鑒定到了位於3號染色體上的ETR2基因。etr2-1編碼區發生了一個C到T的突變，導致第66位的氨基酸由Leu突變為Pro，而這一位點處於乙烯受體家族非常保守的區域。將etr2-1基因轉化到野生型擬南芥中，導致轉基因植株出現顯性的乙烯不敏感表型，說明etr2-1突變體的表型確實是由ETR2基因突變所致。

對蛋白序列分析發現，ETR2編碼773個氨基酸，和之前鑒定的乙烯受體ETR1以及ERS具有較高的相似性。蛋白結構方面，ETR2和ETR1具有相同的結構域：一個N端結構域，一個可能的組氨酸激酶結構域以及一個接收結構域（receiver domain），而ERS的接收結構域缺失。但是，就蛋白序列的相似性而言，ETR1和ERS的相似性更高（79%），而ETR2與ETR1和ERS的相似性相對較低（65%和63%）。

通過前面的研究，已經鑒定到了3個可能的乙烯受體，但是基於以下證據，Elliot M. Meyerowitz等仍認為乙烯受體家族可能還有新的成員：

1. 之前篩選到了一個ein4突變體，它具有和乙烯受體突變體相似的乙烯不敏感表型，但是EIN4的基因定位和功能方面的研究還未開展；

2.由於許多乙烯反應突變體只篩選到了一個allele，而且並沒有篩選到ERS突變（ERS通過交叉雜交技術篩選得到），因此乙烯反應突變體的遺傳學篩選應該還沒飽和。

鑒於以上兩點，Elliot M. Meyerowitz課題組通過反向遺傳學的方法，利用交叉雜交（cross-hybridization）技術，對新的乙烯受體家族成員進行了篩選。1998年，相關成果以EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis為題，發表在The Plant Cell上。

文章中以ETR2的cDNA為探針，對擬南芥的基因組進行篩選，篩選到了兩個ETR2的同系物（homolog），其中一個定位到3號染色體上。有意思的是，之前通過遺傳學方法篩選到的ein4突變體，圖位克隆定位到的候選區間和該同系物的候選區間有重疊。並且ein4突變體的表型和之前鑒定到的3個乙烯受體突變體相似，都是顯性的乙烯不敏感，因此科研人員猜測這個ETR2同系物很可能就是EIN4。另外，通過正向遺傳學篩選，又篩選到了兩個ein4的等位突變ein4-2和ein4-3。進一步研究發現，該ETR2同系物確實就是EIN4。EIN4編碼766個氨基酸，和ETR2具有較高的相似性（74%）。

另外一個ETR2同系物定位在1號染色體上，被命名為ERS2，它的氨基酸序列和ETR2以及EIN4的相似性較高（73%和68%）。和EIN4不同，之前並沒有通過遺傳學方法篩選到ERS2的等位突變體，為了驗證基因的功能，通過定點突變的方法將ERS2蛋白第67位的Pro突變為Leu（etr2-1具有相同突變），94位的Ile突變為Phe（etr1-4，ein4-1和ers1-1具有相同突變），並轉化至擬南芥中。轉基因植株在T1代就表現出乙烯不敏感的表型，並且在自交的T2代中，乙烯不敏感表型和轉基因是共分離的，說明ERS2突變可導致顯性的乙烯不敏感。

通過以上研究，一共找到了5個可能的乙烯受體，對這5個基因的表達模式進行分析後發現，它們的時空表達存在一定的差異性。並且，ETR1和EIN4的表達對乙烯處理沒有響應，而乙烯處理後ERS1、ERS2以及ETR2的表達量增加。以上結果說明，這5個疑似的乙烯受體在乙烯信號轉導方面可能存在功能差異。

雖然已經找到了5個候選乙烯受體，但是有一點需要引起我們的注意：之前篩選出的乙烯受體突變體都是顯性突變，而顯性突變有可能是由於loss of function引起，也有可能是由於gain of function引起，所以並不能確定這些基因在乙烯信號轉導中到底起到正向作用，還是反向作用。因此，篩選以上基因的loss of function突變體才能最終確定基因的功能。

還有一個問題，為什麼通過遺傳學方法沒有篩選到受體的loss of function突變體呢？可能有以下三個原因：1.以上受體基因對植物的生長發育是必須的，任一基因發生loss of function突變致死；2.乙烯受體家族可能存在功能冗餘，某一受體突變後，並沒有明顯表型；3.以上基因可能並不參與乙烯感知，它們loss of function後並不改變植物的乙烯反應。

因此，通過篩選以上受體基因顯性突變的基因內抑制子的方法，也許能夠篩選出loss of function突變體。所謂基因內抑制子，在此處是指在發生顯性突變的同一基因內部又發生了另一突變，抑制或部分恢復原突變體乙烯不敏感的表型。使用基因內抑制子篩選的方法，Elliot M. Meyerowitz課題組成功鑒定到了乙烯受體loss of function的突變體，相關結果以Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis thaliana為題於1998年在Cell上發表。

通過EMS誘變的方法，成功篩選到了ETR1、ETR2和EIN4的loss of function突變體，這些突變體都是發生了提前終止或者剪切錯誤，為隱性突變，可恢復原突變體乙烯不敏感的表型。另外，鑒於在之前的誘變中沒有篩選到ERS2的突變體，因此採用篩選T-DNA插入突變體庫的方法，篩選到了ERS2 loss of function突變體。

對這些loss of function突變體的乙烯反應表型研究後發現，單突並沒有明顯的乙烯反應缺陷表型，單突雜交後得到的雙突表型也不明顯，直到三突和四突才表現出明顯的組成型乙烯反應的表型。說明乙烯受體家族存在嚴重的功能冗餘，這也解釋了為什麼之前沒有篩選到乙烯受體loss of function突變體。由於乙烯受體loss of function突變體三突和四突表現出組成型的乙烯反應，這說明和大多數受體的正調控機制不同，乙烯受體在乙烯信號轉導通路中起到負調控的作用。也就是說，在沒有乙烯時，受體處於激活的狀態；當有乙烯時，受體的活性反而被抑制。另外，由於乙烯受體loss of function突變體表型和顯性突變體表型相反，因此顯性突變應該屬於gain of function。

2005年，Bleecker實驗室在The Plant Journal上發表了一篇題為Ethylene-binding activity, gene expression levels, and receptor system output for ethylene receptor family members from Arabidopsis and tomato的文章，發現擬南芥的五個候選乙烯受體和乙烯分子都具有高親和的結合活性。

至此，就集齊了乙烯受體家族基因作為乙烯受體的三大證據，確立了乙烯受體家族的地位：

1. 這些基因的突變體都可導致植株的各個組織和器官在所有生理時期都表現乙烯反應缺陷的表型；

2. 在所有已知的乙烯信號組分中，這些候選受體基因都位於遺傳學上游（具體內容後續會逐步介紹）；

3. 具有特異的乙烯結合活性。

通過以上解讀我們發現，乙烯受體開創性的研究大部分都是Meyerowitz實驗室完成的。其實，這種現象在科學研究中是非常常見的。一個實驗室專註於某一領域，進行深入系統的研究，建立非常完善的體系。科學研究其實就像一個連環案，一個案件破解了，往往又引出下一個案子的線索。而科學家們就像福爾摩斯，用他們那一雙慧眼在錯綜複雜的事件中發現關鍵線索，破解一個又一個撲朔迷離的案件背後的真相，數十年如一日，樂此不疲。

【參考文獻】

Chang, C., Kwok, S. F., Bleecker, A. B., & Meyerowitz, E. M. (1993). Arabidopsis ethylene-response gene ETR1: similarity of product to two-component regulators. Science, 262(5133), 539-544.

Hua, J., Chang, C., Sun, Q., & Meyerowitz, E. M. (1995). Ethylene insensitivity conferred by Arabidopsis ERS gene. Science, 269(5231), 1712-1714.

Sakai, H., Hua, J., Chen, Q. G., Chang, C., Medrano, L. J., Bleecker, A. B., & Meyerowitz, E. M. (1998). ETR2 is an ETR1-like gene involved in ethylene signaling in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(10), 5812-5817.

Hua, J., Sakai, H., Nourizadeh, S., Chen, Q. G., Bleecker, A. B., Ecker, J. R., & Meyerowitz, E. M. (1998). EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. The Plant Cell, 10(8), 1321-1332.

Hua, J., & Meyerowitz, E. M. (1998). Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis thaliana. Cell, 94(2), 261-271.

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