哺乳期的母親有多勇敢？

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作者:@Cohen

審稿:@蘇雲菌

催產素 （oxytocin，OXT）是由九個氨基酸組成的神經肽，其合成局限於下丘腦的兩個相鄰區域—室旁核（paraventricular nuclei ,PVN）和視上核（supraoptic nuclei ,SON）[1]，催產素的獨特性在於它的作用二元性：一方面，這兩個神經核中的大細胞—催產素能的神經元投射到垂體後部，在那裡它們分泌催產素到外周血系統[2]，另一方面，這些神經元大多數也通過軸突側支靶向特定的腦區並在其中釋放催產素[3]。因此，由這些細胞釋放的催產素既可作為外周神經激素，也可作為大腦內的神經調質。雖然催產素的這兩種看似不同的活性模式之間的確切關係尚不清楚，但最近的很多研究為我們闡明這個問題帶來了新的看法[4]。

催產素在外周中最為確定的作用是與母性行為有關的，例如分娩和泌乳[5]。催產素在血液中的釋放在分娩期間的子宮收縮中起著關鍵作用，並且對泌乳期間的乳汁排出反射至關重要。因此，毫不奇怪，子宮和乳腺中的催產素受體（ oxytocin receptor，OXTR）表達水平以及血液中的催產素水平在分娩前明顯上升並且在哺乳母親中保持較高水平。同時，在許多腦部區域中（包括與情緒相關的邊緣系統）的催產素受體水平在分娩前也有所提高[6]，暗示了催產素可能參與調節母親的情緒行為。早期的研究表明，泌乳期的大鼠相比未孕大鼠更不容易感到害怕，且對同種個體更具攻擊性。例如，在由恐懼誘發而表現出的「全身凍結」反應時間上，泌乳期鼠媽媽相比未孕大鼠要短很多[7]。這些由母性誘導的行為適應被認為是由催產素介導的，且要求催產素的中樞和外周作用之間的協調。

圖1.小鼠的全身凍結反應。凍結行為或凍結反應是對特定刺激的反應，最常見於被捕食動物中。當一隻獵物被捕食者捕獲並被捕食者完全征服時，獵物仍有可能通過假死使捕食者停止攻擊從而逃脫。研究通常使用刺耳音調或電擊來配對一些先天不會引起恐懼的刺激(條件性刺激)，來引起條件性凍結行為反應。對刺激的反應通常被描述為「戰鬥或逃跑」，但更完整地描述為「戰鬥，逃跑或凍結」，在戰鬥或逃跑反應的前後也觀察到凍結反應。

在一項研究中，Menon等人針對小鼠使用了一種稱為社交恐懼條件反射的行為範式。在這裡，非條件刺激是指足部電擊，條件刺激是指與其他同類小鼠的社交活動。在第一天，將足部電擊和特定的社交刺激配對，習得對社交活動的恐懼反射；第二天，對小鼠進行消退程序（條件反射建立後，如果只反覆給予條件刺激，不再用非條件刺激強化，經過一段時間後，條件反射效應逐漸減弱，甚至消失，這稱為條件反射的消退），包括三次暴露於非社交性的控制刺激，然後是六次暴露於社交刺激中，沒有電擊；在第三天，小鼠經歷回憶程序，其中包括六次暴露於相同的社交刺激中。這種範式以前只在雄性小鼠身上使用[8]，能夠顯示出誘發的社交恐懼的程度以及恐懼消退的時間過程。結果發現，未孕小鼠顯示出的強烈社交恐懼反應，在消退程序中逐漸消退了，而哺乳期母鼠的表現則跟完全沒有經歷過條件反射的動物相似，沒有產生社交恐懼反應。

圖2. 社交恐懼條件反射的行為範式及其行為表現結果。在第一天，習得對社交活動和電擊的之間條件性恐懼反射；第二天，進行消退程序，用無電擊的社交活動，來消退恐懼；第三天，將小鼠暴露於相同的社交刺激中，經歷回憶程序，然後記錄相應的行為表現。行為表現結果如右下角所示：藍色代表未孕小鼠，紅色代表泌乳期小鼠，實線表示習得條件性恐懼反射組（SFC+），虛線表示無條件恐懼反射組（SFC-）。可以看出，泌乳期小鼠習得了非社交活動的條件性恐懼反應，而沒有習得出條件性社交恐懼反應，而進行相同操作的未孕小鼠則習得出條件性社交恐懼反應。

研究者們然後使用針對神經活性標記cFos的免疫染色來鑒定哺乳小鼠和未孕小鼠在社交恐懼反應期間表現出神經激活差異的腦區。他們發現哺乳特異性的cFos僅在外側隔核（lateral septum，LS）中表達顯著降低，而先前的研究發現該區域中催產素的活動可增強雄性小鼠社交恐懼反應的消退[8]。

圖3. 根據cFos免疫陽性神經元的數量來顯示在未孕小鼠和哺乳小鼠中外側隔核神經元激活的程度。藍色Vir是指未孕小鼠組，而紅色Lac指哺乳小鼠組。在小鼠習得條件性社交恐懼反射（SFC-）、無條件社交恐懼反射（SFC+）和社交恐懼消退（Ext）後90分鐘時將其處死進行檢測，發現cFos僅在外側隔核中表達顯著降低。 （註：cFos蛋白是即刻早期基因cfos轉錄翻譯的產物，是一種核內磷酸化蛋白。基礎狀態下，cFos蛋白在中樞神經系統的水平非常低，然而在各種應激狀態下，cFos蛋白的表達能夠被瞬時快速地誘導，由於cFos蛋白的誘導表達能在很大程度上反映應激誘導的神經元活動情況，故其常被作為神經元激活的標誌）。

接著，為了探測外側隔核中哪些神經元表達催產素受體，他們使用基因修飾小鼠，使得綠色熒光蛋白GFP在催產素受體特定表達的細胞群中特異性表達，發現了在外側隔核的calbindin陽性的抑制性中間神經元群中的催產素受體的特定表達。使用微量透析在社交恐懼反應發生之前、期間和之後分別監測外側隔核中催產素釋放的水平，研究者們發現哺乳母親在恐懼反應期間測量的催產素水平顯著增加，而未孕雌性小鼠沒有觀察到這種增加。

圖4. 外側隔核中催產素釋放激活該腦區中的抑制性中間神經元。首先，使用OXTR報告基因，研究者能夠確定外側隔核中的大多數OXTR陽性神經元對於鈣結合蛋白calbindin（CB）也是陽性的，而calbindin是GABA中間神經元的一個標記[9]，這表明這些神經元是抑制性GABA能的（圖4I-4L）。其次，量化了支配未孕小鼠和哺乳小鼠外側隔核的催產素纖維的數量，檢測到哺乳小鼠（圖4N和4Q）中的催產素陽性纖維數量與未孕小鼠（圖4M和4Q）相比增加了一倍。

為了繼續驗證這一假設，Menon 等人以各種方式操縱外側隔核中的催產素系統，發現將催產素注射到外側隔核中以及在該大腦區域中OXTR的過度表達顯著降低了他們的社交恐懼反應。相比之下，向外側隔核注射OXTR拮抗劑以及敲除OXTR基因，將哺乳期母親的恐懼反應提高到與未孕雌性小鼠相似的水平。這些實驗證實外側隔核中催產素的釋放減少了哺乳母親的社交恐懼。

下一步，他們旨在確定外側隔核中催產素的神經支配來源，並試圖理解為什麼它在哺乳母鼠中比在未孕雌性小鼠中更活躍。令人驚訝的是，Menon等人使用逆行病毒載體追蹤支配外側隔核的催產素神經元，發現外側隔核中催產素纖維的主要來源是視上核中催產素神經元群（見圖5）。因為之前的研究關於催產素的大部分行為效應被發現來自室旁核神經元[10]，而視上核神經元通常被忽略。事實上，使用遺傳藥理學操作抑制這些神經元的神經活動卻明顯地增強了哺乳期母鼠的社交恐懼反應，並且阻止了這種恐懼反應的消退。

圖5. 外側隔核中催產素纖維的主要來源是視上核中催產素神經元群。為了分析催產素能神經元投射到外側隔核神經元的性質，使用逆行示蹤劑熒光金Fluorogold腹腔注射哺乳期小鼠，而Fluorogold僅在缺乏血腦屏障的區域（例如神經垂體）中被軸突末端吸收，從而使得投射到神經垂體的大細胞神經元能夠被識別出來。對冠狀切片的OXT（綠色）、mCherry（紅色）和Fluorogold（藍色）共同染色顯示，投射到外側隔核的大約83％的下丘腦催產素神經元起源於視上核。

因此，這項研究的結果取得了雙重突破。首先，他們顯示視上核的催產素纖維對外側隔核的神經支配發揮了明確的行為作用，這表明不僅以前認為的室旁核，視上核在催產素介導的社交行為調節中也發揮重要作用。其次，他們表明這種神經支配在泌乳母親中得到增強，這是一種導致外側隔核中催產素釋放增加的塑性過程，通過激活局部的抑制性的GABA能中間神經元，催產素的增強釋放抑制了外側隔核中的神經活動，進而減弱了母親的社交恐懼反應。

圖6. 視上核投射的外側隔核的催產素在哺乳期間減輕社交恐懼。視上核-外側隔核催產素能神經元的活性增強使得外側隔核中催產素釋放增加，從而激活局部表達OXTR的GABA能神經元，減弱了泌乳母鼠的社交恐懼反應，也可能通過下游區域，如腹內側下丘腦等，提升參與社交活動的動機。

在最近發表的另一項研究中[11]，研究者們使用氣味恐懼條件反射範式，表明了催產素在中央杏仁核中起重要作用，以防止哺乳期母親產生因恐懼引起的適應性「全身凍結」反應，從而使他們能夠積極保護幼鼠。這些發現揭示了哺乳期催產素升高導致的外周生理作用（如分娩和泌乳）與中央腦活動的行為調節作用（減弱社交恐懼反應）之間的協調性。由此，對於催產素的這兩種看似不同的活性模式之間的確切關係？最起碼我們可以說，它們共同作用使得泌乳期母鼠在恐懼面前散發勇敢的母性，無畏恐懼。因此，這些研究表明催產素系統中樞腦與周邊之間的二分法是不恰當的，它們應該作為一種完整形式來探索。從更廣泛的角度來看，在社交性嚙齒動物及人類中，催產素系統會影響群體動態，而不僅僅影響個體活動，通過「犧牲」掉母代個體利益來保護後代，從而更大程度上增加群體的利益和適應性。

參考文獻

1. Grinevich, V., Knobloch-Bollmann, H.S.,Eliava, M., Busnelli, M., and Chini, B. (2016).Assembling the puzzle: pathways of oxytocin signaling in the brain. Biol. Psychiatry 79,155–164.

2. Leng, G., Pineda, R., Sabatier, N., and Ludwig,M. (2015). 60 years of neuroendocrinology: the posterior pituitary, from Geoffrey Harris to our present understanding. J. Endocrinol. 226, T173–T185.

3. Knobloch, H.S., Charlet, A., Hoffmann, L.C.,Eliava, M., Khrulev, S., Cetin, A.H., Osten, P.,Schwarz, M.K., Seeburg, P.H., Stoop, R., et al.(2012). Evoked axonal oxytocin release in the central amygdala attenuates fear response.Neuron 73, 553–566.

4. Menon, R., Grund, T., Zoicas, I., Althammer,F., Fiedler, D.,Eliava, M., et al.(2018). Oxytocin signalling in the lateral septum prevents social fear during lactation. Curr. Biol. 28, 1066–1078.e6.

5. Russell,J.A.,andLeng,G.(1998).Sex,parturition and motherhood without oxytocin?J. Endrocrinol. 157, 343–359.

6. Gimpl, G., and Fahrenholz, F. (2001). The oxytocin receptor system: structure, function,and regulation. Physiol. Rev. 81, 629–683.

7. Hansen, S., and Ferreira, A. (1986). Food intake, aggression, and fear behavior in the mother rat-control by neural systems concerned with milk ejection and maternal behavior. Behav. Neurosci. 100, 64–70.

8. Zoicas, I., Slattery, D.A., and Neumann, I.D.(2014).Brain oxytocin in social fear conditioning and its extinction: involvement of the lateral septum.Neuropsychopharmacology39,3027–3035.

9. Zhao, C., Eisinger, B., and Gammie, S.C. (2013). Characterization of GABAergic neurons in the mouse lateral septum: a double fluorescence in situ hybridization and immunohistochemical study using tyramide signal amplification. PLoS ONE 8, e73750.

10. Lee, H.J., Macbeth, A.H., Pagani, J.H., andYoung, W.S.,3rd (2009). Oxytocin: the greatfacilitator of life. Prog. Neurobiol. 88, 127–151.

11. Rickenbacher, E., Perry, R.E., Sullivan, R.M.,and Moita, M.A. (2017). Freezing suppression by oxytocin in central amygdala allows alternate defensive behaviours and mother-pup interactions. eLife 6, e24080.

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