蛋白標籤整理~

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一. 常用的蛋白標籤有哪些？

HIS標籤

His標籤是當前最為熱門的標籤蛋白之一。His6是指六個組氨酸殘基組成的融合標籤，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標籤的使用，一是能構成表位利於純化和檢測；二是構成獨特的結構特徵（結合配體）利於純化。組氨酸殘基側鏈與固態的鎳有強烈的吸引力，可用於固定化金屬螯合層析（IMAC），對重組蛋白進行分離純化。

Flag-tag

Flag標籤蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。

AviTag

是一個15個氨基酸的短肽，具有一個單生物素化賴氨酸位點，與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標蛋白的N端和C端。融合表達後，可被生物素連接酶生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用於蛋白質分離純化，還用於蛋白質相互作用研究。

SNAP-Tag

SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）獲得。SNAP所帶的活性巰基位點接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側鏈苯甲基基團，釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價結合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團所帶的標記物。

檢測：生物素或各種顏色熒光的底物（如熒光素、若丹明）可滲透進入細胞，方便快捷地進行活細胞內SNAP-Tag融合蛋白的標記與檢測。它們也可特異性地標記大腸桿菌，酵母和哺乳動物等細胞抽提液或已經純化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。

將純化的或未純化的SNAP-Tag融合蛋白與表面固定了苯甲基鳥嘌呤的基質混合，蛋白即可特異與底物作用，形成共價鍵，融合蛋白間接被固定在了基質表面上，可以達到更方便快捷地研究蛋白功能或純化蛋白的目的。

GST（谷胱甘肽巰基轉移酶）

GST標籤蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶，它的天然大小為26KD。GST融合表達系統廣泛應用於各種融合蛋白的表達，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。結合的融合蛋白在非變性條件下用10mM還原型谷胱甘肽洗脫。GST標籤可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標籤有助於保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解並提高其穩定性。

純化：該表達系統表達的GST標籤蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹脂進行純化。

如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。

檢測：可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。

GFP

GFP（綠色螢光蛋白）是由下村修等人在水母中發現的。它在藍色波長範圍的光線激發下，會發出綠色螢光。GFP標籤可位於蛋白質的C端或N端，該系統已廣泛應用於各種細胞類型，包括細菌、酵母和哺乳動物細胞等，相應的GFP標籤抗體也被廣泛應用。GFP在檢測蛋白表達、蛋白和細胞熒光示蹤、研究蛋白質之間相互作用和構象變化中，起到了重要的作用。

常規化的c-Myc

C-Myc標籤蛋白，是一個含11個氨基酸的小標籤，它作為抗原表位表達在不同的蛋白質框架中可識別其相應抗體。C-Myc tag已成功應用在Western-blot雜交技術、免疫沉澱和流式細胞計量術中，可用於檢測重組蛋白質在靶細胞中的表達。

熒光素酶（luciferase）:

來源於生物體內的熒光素，常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶。這些熒光素酶作為「報告蛋白」被用於分子生物學研究中，這種技術被稱為報告基因檢測法或螢光素酶檢測法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白標籤不同，使用熒光素酶構建的報告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用於研究啟動子、miRNA 3UTR克隆的功能與調控，因為它們對目的基因的調控可以是漸變的，而不是簡單的開和關兩種狀態。

二、常用蛋白標籤優缺點對比

HIS標籤

主要應用：His標籤融合蛋白也被用於蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA相互作用研究

優缺點：1.標籤的分子量小

2.可在非離子型表面活性劑存在/變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應用，後者在純化包涵體蛋白時特別有用；

3.可應用於多種表達系統，純化的條件溫和；

4.可以和其它的親和標籤一起構建雙親和標籤。

5、免疫原性相對較低；

Flag-tag標籤：

主要應用： 廣泛的應用於蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關領域，在真核表達系統中表達效率更高。

優缺點：1.其通常不會與目的蛋白相互作用，便於研究人員對融合蛋白進行下游研究。

2.其目的蛋白，可直接通過FLAG進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，並且純化效率高。

3.其可以被抗FLAG的抗體識別，便通過Western Blot、ELISA等方法對含有FLAG的融合蛋白進行檢測、鑒定。

4.融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。

AviTag標籤：

主要應用： 除了用於蛋白質分離純化，還用於蛋白質相互作用研究。

優缺點：1.無論在體外或者體內，幾乎所有的蛋白都可以在一個獨特的Avi Tag位點輕易且有效地被生物素化；

2.生物素化是通過酶和底物的反應來實現，反應條件相當溫和而且標記的專一性極高；

3.生物素AviTag只有15個氨基酸，對蛋白空間結構的影響非常小。

SNAP-Tag標籤：

優缺點：1、不僅專一性極高而且穩定；適用於多種環境下的蛋白質檢測與純化，如活細胞內、溶液中、或固態相(如SDS-PAGE gels)等。

2、無論體內還是體外，SNAP標籤反應是高特異的。

GST 標籤：

主要應用：GST融合表達系統廣泛應用於各種融合蛋白的表達，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。

優缺點： 1、它是一個高度可溶的蛋白；

2、它可在大腸桿菌中大量表達，起到提高表達量的作用。

3、在大多數情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，並形成二體。GST標籤可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標籤有助於保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解並提高其穩定性。在大多數情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

c-Myc 標籤：

主要應用：應用在 Western-blot雜交技術、免疫沉澱和流式細胞計量術中, 可用於檢測重組蛋白質在靶細胞中的表達。 含11個氨基酸作為抗原表位表達在不同的蛋白質框架中仍可識別其相應抗體。

熒光素酶標籤：

主要應用： 常用於研究啟動子、miRNA 3UTR克隆的功能與調控

優缺點： 1.靈敏度高，檢測幅度寬；

2.不是哺乳動物細胞內源性基因；

3.重複性好；

4.與HTS兼容等。

三、 該如何選擇表達克隆的標籤

1、首先，需要確定融合標籤的目的

蛋白純化 ：標籤的普遍用途是蛋白純化。小分子6XHis Tag常被用於細胞內源蛋白的純化。6XHis Tag也廣泛應用於大腸桿菌的蛋白純化。可是哺乳動物細胞中因非分泌蛋白自身存在高組氨酸背景，因此極少使用6XHis Tag。

Western Blot檢測：若需要做Western Blot實驗來檢測細胞裂解物中蛋白的表達，你可以選擇有匹配的抗體的小分子標籤。FLAG? Tag以其分子量小以及擁有許多與之匹配的商業化的抗體等優勢，成為Western Blot實驗中常用的Tag。

免疫沉澱反應：FLAG? Tag其分子量小以及擁有大量相匹配的商業用抗體等優勢成為免疫沉澱反應中最常用的Tag. 其他常用的標籤有：HA和cMyc.

活細胞成像：熒光蛋白（Fluorescent Proteins, FPs）是活細胞成像常用的標記蛋白。其中最常用的是綠色熒光蛋白（GFP）和它的衍生物（CFP, YFP, etc.），以及一些紅色變體，如dTomato和mCherry.

2、考慮融合標籤的影響

任何一類標籤處於氨基酸序列的任一位置，都具有影響目的蛋白表達或功能的可能性。最主要原因是標籤可能會干擾蛋白的正確摺疊，致使目的蛋白失活或形成包涵體。其次，標籤可能會中斷亞細胞定位信號，這種情況下，蛋白能夠正確翻譯和摺疊，但在細胞內所處的位置是錯誤的。因此，您需要知道添加的標籤對目的蛋白的表達是否有影響。

3、考慮是在N-端還是C-端標記

N-端或C-端標記的選擇還需要根據蛋白結構、定位等特性。然而，倘若你沒有確切的蛋白結構，或蛋白功能域圖譜，建議分別構建N-端標記和C-端標記的表達克隆，以檢測哪個更有效。

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醫學實驗彩雲老師13576988994 QQ微信1526328080

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