【小鼠大學問】條件性基因敲除小鼠，高分paper必殺器

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最近好多諮詢都是問條件性敲除到底好在哪？到底怎麼用？ 為什麼能用來驗證基因敲除實驗的結果？一個一個回答太累，乾脆今天就來具體說一下條件性敲除和普通基因敲除的區別。

全身性基因敲除 or 條件性基因敲除

全身性基因敲除

也就是我們常說的 KO（Knockout），也叫完全基因敲除，是指在小鼠所有組織細胞中，將靶基因的某些重要外顯子或功能結構域、甚至所有外顯子敲除掉，導致靶基因的表達缺失。

應用：

• 研究目的基因對全身生理或病理的功能

優勢：

• 小鼠模型構建周期短
• 交配流程簡單

劣勢：

• 大約有1/3的基因純合敲除後會導致小鼠胚胎期死亡或出生期死亡
• 引發其它基因的代償，導致基因敲除後沒有明顯表型改變

條件性基因敲除

CKO（Conditional Knockout），將某個基因的修飾限制於小鼠某些特定類型的細胞或發育的某一特定階段，實現對小鼠基因組的時空特異性修飾。

應用：

• 胚胎致死性基因的研究
• 研究靶基因在特定組織或細胞中的功能
• 研究靶基因在特定時期或階段發揮的作用

優勢：

• 多功能的基因敲除模型，可與不同工具鼠靈活搭配使用，客觀而系統地研究目的基因在不同組織器官發生、發育或疾病發生、治療過程中的作用與機制
• 克服了重要基因完全敲除後的胚胎致死或過早死亡

劣勢：

• 交配流程較為複雜
• 小鼠模型構建周期相對較長

CKO之於高分Paper

為什麼說擁有條件性基因敲除小鼠模型以後更容易發高分文章呢？

一篇好文章，意味著我們需要一個好故事。時間、地點、人物，這故事的三大基本要素自然是缺一不可！

簡單的來說，故事的主人公就是我們所研究的基因。而 CKO 除了可以明確目的基因的缺失在特定組織或細胞類型之中發生，還可以限制發生的特定時間。

與普通的 KO 相比，CKO 無疑提供了更精準確鑿的不在場證明。這樣的故事當然也就更有說服力，再也不怕 reviewer 質疑啦！

關於CKO你一定要知道的"4W"

HOW CKO 是如何實現的？

條件性基因敲除的基本原理是重組酶系統（如：Cre-loxP）介導的位點特異性重組技術。

Cre-loxP 系統，是目前最常用的重組酶系統之一，它是來自於大腸桿菌噬菌體 P1 的重組酶系統。Cre 是重組酶（38kDa），可識別 34bp 長的 DNA 序列 loxP。loxP 兩側各 13bp 構成迴文結構，中間 8bp 為非迴文結構，因此 loxP 具有方向性。

• 當 DNA 分子上存在兩個同向 loxP 序列時，Cre 可將兩個 loxP 序列之間的DNA 片段切出並環化，同時將 loxP 兩側的序列進行連接。
• 當 DNA 分子上存在兩個方向相反的 loxP 序列時，Cre 可導致 loxP 之間的序列發生反轉。

WHAT CKO 敲除的是什麼？

條件性基因敲除的靶基因中必須帶有可以被 Cre 重組酶識別的 loxP 序列，這種基因稱為 floxed gene。

帶有 floxed 靶基因的小鼠稱為 flox 小鼠。在這種小鼠中，通常採用 DNA 同源重組方法，在擬敲除基因片段的兩側分別放置一個同向的 loxP 位點。

loxP 位點的存在應不影響該基因的功能。

WHERE & WHEN CKO 何時何地發生？

除了 flox 小鼠以外，重組酶系統介導的條件性基因敲除還需要另一類重要的基因工程小鼠的參與——Cre 工具鼠。

Cre 工具鼠中，將 Cre 重組酶的編碼序列置於特定的基因啟動子下，Cre 的表達特性決定了靶基因何時何地發生敲除。

Cre 在哪一種組織細胞中表達，靶基因的敲除就發生在哪種組織細胞；Cre 的表達水平將影響靶基因在此種組織細胞中進行修飾的效率；使用誘導型Cre 重組酶可以通過給予誘導劑，決定在特定的發育時期或疾病發生階段，定時地進行基因敲除。

影響 Cre 表達 pattern 的的因素包括：

• Cre 上游的特異性啟動子

廣泛型或組織特異性

• Cre 工具鼠的構建方式

隨機整合或定點敲入

• Cre 的類型

組成型或誘導型

實驗時，將 flox 小鼠和 Cre 工具鼠進行交配，最後獲得 flox 純合且 Cre 雜合的小鼠。在這類小鼠中，凡是表達 Cre 的細胞，兩個 loxP 之間的序列被切除，從而實現組織特異性基因敲除。

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