年終盤點：2016年CRISPR基因編輯領域突破性進展一覽

08-06

近年來，隨著生物技術突破性的變革及科學家們不斷的努力，新的基因編輯技術不斷湧現出來，推基因編輯，繼ZFN，TALENs基因編輯技術的推出，又出現了當下最熱門最新型的CRISPR/Cas9基因編輯系統。

CRISPR/Cas系統是目前發現存在於大多數細菌與所有的古菌中的一種後天免疫系統，其以消滅外來的質體或者噬菌體並在自身基因組中留下外來基因片段作為「記憶」。CRISPR/Cas系統全名為常間迴文重複序列叢集/常間迴文重複序列叢集關聯蛋白系統(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。

以CRISPR/Cas9為基礎的基因編輯技術在一系列基因治療的應用領域都展現出極大的應用前景，比如艾滋病、血液病、腫瘤等其它多種遺傳性疾病。我們總是感慨時光過得很快，這不，2016年即將接近尾聲，迎接我們的將是嶄新的2017年，2016年CRISPR基因編輯技術領域又有哪些突破性的研究進展呢？本文中小編就對此進行了盤點，分享給各位！

【1】Nature：中國首次利用CRISPR–Cas9編輯過的細胞開展人體臨床試驗

doi：10.1038/nature.2016.20988

來自中國成都市四川大學華西醫院的一個研究人員團隊首次將利用CRISPR–Cas9進行過基因編輯的細胞注射到一名病人體內。《自然》期刊報道這一注射過程是在2016年10月28日發生的，而且迄今為止，這名病人表現得「還不錯」。

經過基因修飾的細胞之前已被注射到人體內，但是是利用不同的技術實現的。CRISPR-Cas9被認為是一種更加高效的方法。在這項新的努力中，該團隊從血液樣品中分離出免疫細胞，然後利用CRISPR-Cas9尋找它們中的PD-1蛋白，並且讓該蛋白不能發揮功能，而之前的研究已證實這會延緩免疫細胞作出的免疫反應。人們的看法是讓這種蛋白失去功能將允許免疫系統更強地抵抗腫瘤生長。這些利用CRISPR-Cas9進行過基因編輯的細胞被放置在一個容器中，在那裡，它們在體外培養後能夠發生增殖---它們隨後經收集後被注射到一名肺癌病人體內，其中這名病人已不能夠對任何其他的療法作出反應。

【2】科學家首次利用CRISPR/Cas9技術成功糾正小鼠的凝血功能

新聞閱讀：Scientists use CRISPR for first time to correct clotting in newborn and adult mice

CRISPR/Cas9，一把強大的基因魔剪，其在有效糾正引發疾病的突變上表現出了巨大潛力，近日，在聖地亞哥舉辦的第58屆美國血液學會年會和博覽會上，來自賓夕法尼亞大學的研究人員通過研究首次開發出了一種雙基因療法，其能夠將CRISPR/Cas9介導的基因靶向系統的關鍵組分運輸到小鼠機體中來治療B型血友病（Hemophilia B），這是一種第九因子缺乏症，該疾病通常是由於凝血蛋白缺失或缺陷引發。

在諸如血友病等很多單基因疾病中，不同的突變往往會分散在特殊的基因中，而並不是一種單一的佔優勢的突變，因此研究人員就需要開發出一種載體能夠用於攜帶任何突變的患者；本文研究是一項概念性的驗證研究，研究者利用了通用的CRISPR/Cas9基因靶向方法來用於治療大部分特殊疾病的患者，就比如B型血友病，據美國CDC數據顯示，血友病在活產嬰中的發生率為5000分之一，兒在美國目前大約有2萬名血友病患者。

【3】JNCI：重磅！科學家利用CRISPR/Cas9技術使癌症突變失活

doi：10.1093/jnci/djw183

由於在許多生物醫學和生物技術領域均有著廣泛的應用，「基因魔剪」CRISPR/Cas9或將完全打開癌症研究領域的大門；日前一項刊登在國際雜誌Journal of the National Cancer Institute上的研究報告中，來自德國德累斯頓工業大學（Dresden University of Technology）等機構的研究人員通過研究發現，扮演癌症驅動子的突變或許能夠被靶向作用並且修復，而且這些相關的突變也可以被快速診斷，並被用來改善個體化療法。

作為生物技術研究領域的革命性工具，CRISPR/Cas9在生物醫學研究上有著其廣泛的用途，其可以實現對細胞基因組中特定位點的DNA進行切割，如今研究人員就發現了一種方法，能夠利用該技術診斷並且使得癌症突變失活，從而加速癌症領域的研究。研究者Frank Buchholz說道，通過新一代測序技術我們就能夠快速鑒別出癌細胞中的突變，但很多時候我們並不知道到底是哪些突變能夠驅動疾病的發生，而且哪些突變是相對良性的。

【4】Science：重磅！史上首次利用CRISPR-Cas9讓人細胞變身為記憶存儲系統

doi：10.1126/science.aag0511

在一項新的研究中，來自美國麻省理工學院（MIT）的研究人員設計出一種方法在人細胞的DNA中記錄複雜的歷史事件，從而允許他們通過對這種DNA進行測序從中找回過去事件的「記憶」。相關研究結果於2016年8月18日在線發表在Science期刊上，論文標題為「Continuous genetic recording with self-targeting CRISPR-Cas in human cells」。論文通信作者為MIT電學工程與計算機科學副教授和生物工程副教授Timothy Lu。論文第一作者為Samuel Perli博士和研究生Cheryl Cui。

這種模擬記憶儲存系統---首先能夠在人細胞中記錄事件的持續時間和/或強度---可能也能夠允許科學家們研究幹細胞在胚胎髮育期間如何產生多種組織，細胞如何對環境條件作出反應以及它們如何發生導致疾病產生的基因變化。

Lu說，「為了能夠更加深入地理解生物學，我們對人細胞進行基因改造，使得它們能夠基於基因編碼的記錄器報道它們自己的歷史事件。」他補充道，這種技術應當允許深入認識基因調節和細胞內發生的其他事件如何導致疾病產生和發育。

【5】Cell Stem Cell：利用改造的CRISPR/Cas9技術直接改變細胞身份

doi：10.1016/j.stem.2016.07.001

在一項新的研究中，研究人員利用經過基因修飾的CRISPR/Cas9---一種新的革命性的基因編輯技術---將從小鼠結締組織中分離出的成纖維細胞直接轉化為神經元。

2006年，日本京都大學前沿醫學科學研究所山中伸彌教授發現如何讓來自成年結締組織的成纖維細胞返回到未成熟的能夠分化為任何一種細胞類型的幹細胞。這些所謂的誘導性多能幹細胞（ips細胞）因在研究和醫學中的巨大潛力僅在6年後就讓山中伸彌教授獲得諾貝爾獎。

從那之後，科學家們已發現其他的方法將一種類型的細胞轉化為其他類型的細胞。這主要是通過導入多種額外拷貝的「主開關」基因---表達激活特定細胞類型所需的整個基因網路的蛋白---來實現的。

如今，在這項新的研究中，來自美國杜克大學的研究人員開發出一種不再需要導入額外基因拷貝的策略。相反，他們利用一種經過基因修飾的CRISPR/Cas9基因編程技術直接激活已經存在於細胞基因組中的自然拷貝。相關研究結果於2016年8月11日在線發表在Cell Stem Cell期刊上，論文標題為「Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells」。

【6】重磅！中國科學家將進行世界首個人類CRISPR基因編輯臨床試驗

新聞閱讀：Chinese scientists to pioneer first human CRISPR trial

如今，中國科學家即將利用CRISPR–Cas9基因編輯技術將修飾後的細胞注入人體進行人類臨床試驗，這將是世界上首個在人類機體中進行的CRISPR試驗。

進行這項研究的是來自四川大學華西醫院（West China Hospital）的研究者Lu You（盧鈾），他計划下個月在肺癌患者機體中檢測利用CRISPR–Cas9修飾後的細胞的性能，這項臨床試驗已於7月6日獲得了醫院倫理審查委員會的批准審核。研究者盧鈾，畢業於華西醫科大學，長期從事肺癌和食管癌等胸部腫瘤放化療和分子靶向治療的臨床與基礎研究，腫瘤綜合治療及抗腫瘤新葯臨床試驗研究。

來自賓夕法尼亞大學從事免疫療法的研究人員Carl June表示，這或許是一項讓我們很多人都非常激動的研究，同時也是一項將CRISPR–Cas9基因編輯技術推向人類臨床試驗的巨大進步。目前科學家們利用許多基因編輯技術來進行人類臨床試驗，其中包括研究者June進行的一項研究，他們當時利用基因編輯技術來幫助患者抵禦HIV，June同時也是一項臨床試驗的科學顧問，這項研究計劃利用CRISPR–Cas9修飾的細胞來用於癌症治療。

【7】利用CRISPR基因編輯技術治療癌症？

新聞閱讀：Treating Cancer with CRISPR？

根據美國國家衛生研究院（NIH）的說法，美國重組DNA顧問委員會（Recombinant DNA Advisory Committee，RAC）下周將審查賓夕法尼亞大學申請首次利用革命性的基因編輯技術CRISPR治療人類癌症的臨床試驗。利用CRISPR技術，科學家們能夠準確地切割靶DNA。

這項臨床研究將從癌症患者體內提取出免疫系統的T細胞。接著，研究人員將利用CRISPR對T細胞進行基因修飾，並將基因修飾後的T細胞灌注回病人體內，這樣它們將靶向摧毀腫瘤細胞。

NIH科學政策副主任Carrie Wolinetz在一篇博客帖子中披露了這一審查信息。賓夕法尼亞大學正在開發的這種癌症免疫療法旨在靶向攻擊骨髓瘤、黑色素瘤和肉瘤。

CRISPR技術是在不到四年前開發出來的，但是已正在沖向臨床應用。在此之前，一家位於美國馬薩諸塞州劍橋市的生物技術公司Editas醫藥公司（Editas Medicine）說，它打算在2017年開展一項利用CRISPR治療一種罕見的眼部疾病的臨床試驗。

【8】三篇Nature文章揭示CRISPR/Cas9基因組編輯取得重大進展

doi：10.1038/nature17946 doi：10.1038/nature17945 doi：10.1038/nature17944

大多數人類遺傳病是由於點突變---DNA序列上的單個鹼基錯誤---導致的。然而，當前的基因組編輯方法不能夠高效地校正細胞中的這些突變，而且經常導致隨機的核苷酸插入或刪除（insertions or deletion， indel）。

如今，在一項新的研究中，來自美國哈佛大學的研究人員對CRISPR/Cas9技術進行改進，構建出一種新的「鹼基編輯器（base editor）」，並且避免這些問題的發生。在人細胞系和小鼠細胞系中，這種鹼基編輯器永久性地和高效地將鹼基胞嘧啶（C）轉化為鹼基尿嘧啶（U），同時具有較低的編輯錯誤發生率。相關研究結果於2016年4月20日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage」。

美國加州大學伯克利分校基因組學創新計劃科學主任Jacob Corn（未參與者這項研究）說，「在人體的任何一個地方，都有大量的遺傳病存在，這些遺傳病本質上是由於鹼基換入或換出。」

【9】Nature子刊：首次利用CRISPR/Cas9在體內成功切除HIV DNA片段

doi：10.1038/gt.2016.41

作為一種RNA病毒，HIV是一種逆轉錄病毒。當感染人細胞（主要是CD4+ T細胞）時，它會將自身的RNA逆轉錄為DNA後插入到宿主基因組中以便進行複製和合成新的病毒顆粒。

在一項新的研究中，來自美國天普大學劉易斯-卡茨醫學院的研究人員利用基因編輯技術首次成功地從活的動物基因組中切除HIV-1 DNA中的一段序列。這一突破是開發一種潛在地抵抗HIV感染的治療策略的關鍵一步。相關研究結果發表在2016年5月19日那期Gene Therapy期刊上，論文標題為「Excision of HIV-1 DNA by gene editing： a proof-of-concept in vivo study」。論文通信作者、天普大學劉易斯-卡茨醫學院神經病毒學中心主任Kamel Khalili博士解釋道，「在這項概念驗證的研究中，我們證實我們的基因編輯技術能夠高效地應用於兩種小型模式動物的很多器官中，而且能夠將HIV病毒DNA的較大片段從宿主細胞基因組中切除。」

當前的治療HIV感染的方法集中於抗逆轉錄病毒藥物的組合使用。儘管抗逆轉錄病毒藥物療法能夠有效地抑制HIV複製，但是這不能夠將HIV-1從被HIV感染的細胞中清除。再者，當抗逆轉錄病毒療法停止時，HIV複製捲土重來，從而使得病人面臨著患上獲得性免疫綜合征（AIDS，一種由HIV感染導致的疾病）的風險。這種潛伏性感染之所以產生是因為HIV DNA能夠持續存在於CD4+記憶T細胞的基因組中和可能其他的細胞儲存庫中，在那裡，HIV病毒保持潛伏狀態，不受當前療法的影響。

【10】Science：基因編輯大牛張鋒再發力，揭示只靶向RNA的新型CRISPR系統

doi：10.1126/science.aaf5573

在一項新的研究中，來自美國國家衛生研究院（NIH）、哈佛大學-麻省理工學院布羅德研究所（簡稱布羅德研究所）、麻省理工學院、羅格斯大學新伯朗士威校區和俄羅斯斯科爾科沃理工學院等機構的研究人員描述了一種靶向作用於RNA而不是DNA的新型CRISPR系統。相關研究結果於2016年6月2日在線發表在Science期刊上，論文標題為「C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector」。

這種新的CRISPR系統有潛力提供一種強大的方法進行細胞操縱。儘管DNA編輯讓細胞基因組發生永久性變化，但是這種基於CRISPR的RNA靶向方法可能允許科學家們讓細胞基因組發生可根據需要進行上下調節的臨時變化，而且比現存的RNA干擾方法具有更大的特異性和功能性。

【11】Nature：重大發現！史上最簡單的CRISPR/Cpf1系統可切割DNA和RNA

doi：10.1038/nature17945

利用CRISPR-Cas9可以非常簡單地、多用途地和可靠地修飾多種有機體中的DNA。這是因為自從它的發現以來，全世界的科學家們一直在努力進一步改進或調整CRISPR-Cas9系統以便滿足他們各自的特定需要。因此，人們很難想像在不使用CRISPR-Cas9的情形下如何對遺傳物質進行基因編輯。

如今，在一項新的研究中，來自德國馬克斯普朗克感染生物學研究所、亥姆霍茲傳染病研究中心和瑞典優密歐大學（Ume？ University）的研究人員描述了酶Cas9的一種潛在替代者---來自土拉熱弗朗西絲菌（Francisella novicida）的CRISPR結合蛋白Cpf1---的特徵：Cpf1表現出雙重切割活性：不僅切割DNA，而且也切割RNA。與CRISPR-Cas9不同的是，Cpf1能夠獨自地對crRNA前體（pre-crRNA，編者註：CRISPR DNA片段經轉錄而形成的CRISPR RNA前體）進行加工，然後利用加工後產生的crRNA特異性地靶向和切割DNA，因而也就不需要來自宿主細胞的核糖核酸酶（RNase）和tracrRNA，這是人們迄今為止發現的一種最簡單的CRISPR免疫系統。這一發現可能給科學家們提供一種新的序列特異性基因組編輯方法，更為重要的是，還可能便於一次對多種靶位點進行編輯，即所謂的多重編輯。相關研究結果於2016年4月20日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA」。論文通信作者為來自馬克斯普朗克感染生物學研究所的Emmanuelle Charpentier。

【12】Trends in Parasitol：CRISPR-Cas9技術把蚊子給「閹了」

doi：10.1016/j.pt.2015.12.003

隨著寨卡病毒、基孔肯亞熱及登革熱爆發的不斷上升，衛生官員迫切需要採取措施阻斷這些病毒的傳播。近來刊登在國際雜誌Trends in Parasitology上的一項研究中，來自弗吉尼亞理工大學（Virginia Tech）的研究者就利用了一種特殊方法，即對雄性蚊子進行基因工程修飾，這或許可以有效阻斷病毒的傳播。

去年研究者們在雄性蚊子中發現了一種名為Nix的基因，而本文研究中研究者討論了如何將CRISPR-Cas9基因編輯技術同Nix基因進行相互結合來有效降低野外雄性和雌性蚊子的配對；雄性蚊子是無害的，因為其僅以花蜜為食；而雌蚊子則需要以血液為食從而幫助其產卵，雌蚊子同時也是引發疾病發生的元兇。

【13】Science & NEJM：利用CRISPR/Cas9有望讓豬成為病人的器官供者

doi：10.1126/science.aad1191 doi：10.1056/NEJMcibr1515623

儘管在農業環境中，豬比較懶散，但是在生物醫學實驗室培養的豬足夠乾淨以至於很多人將歡迎---確實，應當歡迎---使用它們的組織用作拯救生命的移植物。用於移植的心臟瓣膜通常來自豬和奶牛。

但是想要將整個豬器官移植到需要新的心臟、肝臟、腎臟或肺部---異種器官移植（xenotransplantation）的病人體內---並不是這麼簡單的事。除了受者免疫系統傾向於排斥異體組織所面臨的常規挑戰外，利用豬器官填補人器官供應和需求之間的巨大缺口還必需解決豬內源性逆轉錄病毒（porcine endogenous retrovirus， PERV）帶來的問題。

畢竟，PERV是令人毛骨悚然的。在遭受壓力之下，豬細胞泵出PERV，隨後它們能夠感染豬移植器官旨在拯救的病人。在異種器官移植的全新領域---豬能夠為在美國等待器官移植的12萬病人中的一些人提供器官---中，科學家們必需找到一種方法解決來自PERV的威脅。

【14】Science：天吶！CRISPR基因編輯技術或將用於對人類胚胎進行編輯

新聞閱讀：U.K. researcher details proposal for CRISPR editing of human embryos

最熱門的基因編輯技術—CRISPR，或許很快就可以被用來研究人類胚胎了，近日，來自英國的監管委員會將去評估敲除日齡胚胎髮育基因所引發的效應，來自科瑞克研究所的研究人員Kathy Niakan討論了該項目背後的基本原理，同時他們還希望這項調查有一天或將改善人類的不育療法。

這項研究中研究人員揭示了受精卵的單個細胞如何轉化成為胚泡，胚泡是一種大約5日齡的結構，其可以植入到母體的子宮中；胚泡中包含有多種類型的細胞，而最後註定發育成胎兒的細胞稱之為外胚層祖細胞，這些細胞被兩種其他類型的細胞包裹著，其可以發育成為胎盤和其他組織，比如卵黃囊結構，而Niakan在研究中使用了來自生育診所中的人類胚胎，這些胚胎是進行體外受精遺留下來作為研究捐獻使用的，在研究之後當這些胚胎達到7日齡就會被銷毀。

【15】Genome Biol：CRISPR技術新突破！優化sgRNA結構可提高基因編輯效率！

doi：10.1186/s13059-015-0846-3

在一項新的研究中，來自美國德州理工大學健康科學中心的研究人員開發出一種提高CRISPR基因編輯效率的方法，其中CRISPR是一種日漸重要的用來編輯DNA的技術。相關研究結果近期發表在Genome Biology期刊上，論文標題為「Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency」。論文通信作者是Haoquan Wu博士。他是德州理工大學健康科學中心的一名生物醫學家。

Wu說，「全世界的科學家們如今正在他們的研究中使用CRISPR，但是這種技術的功能性並不像是它應當那樣的那麼好。」

CRISPR是一種突破性的允許科學家們對基因進行修飾的技術。兩種關鍵性的組分讓CRISPR的DNA編輯能力成為可能。第一種組分是Cas9，即一種能夠切割DNA的酶。第二種組分是單嚮導RNA（single guide RNA， sgRNA），它精確地引導Cas9在一種DNA序列上進行切割從而讓不需要的片段失活。（生物谷Bioon.com）

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