手把手教你做免疫組織化學IHC實驗

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手把手教你做免疫組化三步法實驗(以SP法為例)

看到很多人發的帖子，我也想把我掌握的免疫組化方法與大家分享，不一定能做到面面俱到，但是融合了步驟和一些原理性東西給大家當基礎知識儲備。要是覺得這不錯，你就點贊或者收藏。有什麼問題也可以留言，我統一整理以後，再以帖子的形式給大家提供我的見解。

一、脫蠟水化：

切片在脫蠟前，放在APES（防止脫片用的，缺點是有低毒性） 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾乾或60°C恆溫箱中烘烤20分鐘，然後將組織切片置於二甲苯中浸泡10min，更換二甲苯再浸泡10min，無水乙醇浸泡 10min，更換無水乙醇再浸泡10min，然後依次95%乙醇，70%乙醇，50%的乙醇各5min，最後用蒸餾水浸泡

原理：

①二甲苯的作用：溶解蠟塊，起到脫蠟的作用；

②梯度酒精是為了除去對人體有害的二甲苯，但高濃度的酒精時間過長會導致組織細胞變形，影響抗原的表達，也會影響到組織在顯微鏡下的光學形態，所以用梯度酒精；

③保持玻片在自來水中，直到準備進行抗原修復。任何時候都不應該使玻片乾燥，乾燥會導致非特異性抗體結合，從而出現高背景染色；

技巧：

①觀察是否脫蠟完全，因為石蠟是不溶於水的，如果石蠟脫不完全，水流上去會模糊還有滯流感。原則就是徹底、乾淨、完全的脫去石蠟。

二、清洗：先用用蒸餾水溫柔的沖洗一會，更換PBS沖洗5min，再用PBS沖洗5min；

注意：沖洗時盡量溫柔，可以多衝洗一會；

①可以將玻片放在卧式缸里，在搖床上輕輕晃3-5min,重複2-3次

三、抗原修復：（此步驟根據實驗可增減）

將切片放入盛有0.01M枸櫞酸緩衝液（PH 6.0）中置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間並持續 10~15分鐘取出容器，室溫冷卻30分鐘；

注意：不可將切片從緩衝液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型；

原理：

①枸櫞酸緩衝液，是抗原修復液的一種，一部分抗體使用這種修復液修復的效果最好。

②對於石蠟切片的免疫組化實驗時，必須經過抗原修復，這將有助於暴露抗原決定簇，從而增加抗原檢測率。修復的方法有很多種，我採用的是熱修復。對於不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所採用的方法應不一樣，可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。

③修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種我們這次實驗用的枸櫞酸緩衝液，此外還有EDTA緩衝液。（具體的可以查閱相關資料，大量的：中性的、高pH的等）。

四、消除內源性過氧化物酶的活性

用3%H2O2滴加到切片上，封閉5-10min去除內源性過氧化物酶。PBS沖洗2-5min，沖洗三次。

特別說明：在一些過氧化物豐富的組織裡面（肝臟、胎盤、血管瘤、急性炎症組織等）3%H2O2

也不能完全消除內源性的過氧化物，改進的方法就是先用3%H2O2阻斷10min,再用0.5%的高碘酸溶液阻斷10min。

五、封閉：用和二抗來源一致的血清在保濕盒中於37℃孵育15~30min，然後甩去封閉用血清，勿洗；

注意：封閉時間根據具體實驗調整；封閉液一般選用5%BSA或與二抗來源一致的血清，切記是BSA，不是PBS.很多論壇寫的是PBS,太坑了。

①使用血清好還是BSA好？

答：第一是待檢樣本會非特異性的和蛋白結合，從而導致背景過高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結合，從這點看，BSA和血清沒有明顯區別。

第二是待檢樣本中可能會有Fc受體，可以和抗體恆定區結合，與抗體特異性無關，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結合。BSA則無法封閉Fc受體。

六、一抗孵育：

滴加適當比例稀釋的一抗，將切片放在保濕盒中於4℃冰箱中過夜孵育或者溫箱37℃孵育1-2個小時。

小技巧：一抗孵育可以是4℃冰箱中過夜孵育，也可以選擇37℃孵育1-2小時。關鍵就是溫度要控制恆定。普遍情況下都選擇4℃冰箱中過夜孵育，因為它的溫度穩比室溫要穩定。

注意：適當比例稀釋是可以查到的，很多說明書或該公司網站產品詳情頁都有，實在不行你直接打電話去問公司的技術支持，他們給的建議更適合他們的產品，可別想當然。

七、清洗：過夜後的切片用PBS沖洗，沖洗3次；

注意：一定要單獨沖洗，多個片子防止交叉反應造成污染；溫柔沖洗，防止切片的脫落

八、二抗孵育：

滴加生物素標記的二抗在保濕盒中於37℃孵育30分鐘。加之前吹乾凈標本上的水（可以用吸水紙沿著材料周圍畫圈把水吸干）

注意：其實抗體孵育過程都是一致的目的都是結合，所以一定要保證在一個環境穩定和穩定恆定的條件下進行，你也許會在實驗室發現一個大紙條寫著實驗中，勿動！

九、清洗：切片用PBS沖洗2min，沖洗3次；

十、滴加適當比例稀釋的HRP標記的親和素，再37℃孵育20min

十一、清洗：用PBS沖洗2min，沖洗3次

十二、顯色：加入顯色劑顯色，選擇DAB（快速滴入，觀察染色情況）根據顯微鏡下的觀察決定終止顯色的時間一般都在3-10min左右，最常用5min。

十三、自來水沖洗：自來水充分沖洗10-15min,

注意：沖洗的時候要注意水流不要太大，緩慢的沖洗。

十四、復染：加一大滴蘇木精復染，細胞核蛋白幾秒就可以，細胞漿或者細胞膜蛋白需要然20-30S，自來水沖洗，再用PBS返藍5min。

注意：

①復染的時間是需要摸索的，這個與蘇木精的配製時間有關。如果是第一次做，可以請教一下實驗室的老師問一下經驗，自己在多備兩個片子，摸索感受一下。

②若試驗目的只是想說明組織中蛋白表達的有無、量的多少和顏色的深淺，那就不需要蘇木素復染；若實驗目的是想看組織切片蛋白定位在胞核還是胞漿，那就最好蘇木素復染；

③復染試劑的選擇與顯色系統相關聯？如果是AEC和DAB系統，那麼顯色應該是紅色和棕黃色，這樣你用蘇木素復染核就不會影響陽性細胞的觀察，更何況你所檢測的抗原位於胞漿中呢。如果你用BCIP/NBT系統顯色，則顯色為紫黑色，此時你復染核就不能用蘇木素了，因兩者的色澤相似。你可以選用甲基綠溶液復染核，這樣核為鮮艷的蘭綠色，不容易與BCIP/NBT系統相混淆了。

④關於返藍的選擇，我估計大家看到很多不同選擇（有水、氨水、PBS、飽和碳酸鋰等等）。本質來說，返藍的原理是蘇木素遇鹼變藍色，所以以上這幾種都是偏弱鹼性的物質。

十五、脫水透明

依次用50%， 70%， 95%酒精各5min浸泡切片，最後用100%酒精浸泡10min，更換酒精浸泡10min，最後用二甲苯浸泡10分鐘，更換二甲苯，再浸泡10min；

注意：梯度酒精的作用：脫水，以便片子長期保存；二甲苯是為了使片子更加透明；

十六、封片

撈出，用樹脂封片，一滴/張,在其上蓋上小玻片

封好的組織切片，放入超凈台中，打開抽風，沖一段時間，最後把切片放在窗台上涼2-3天，就可收起來。

注意：封片用的材料與顯色系統相關：DAB顯色的石蠟切片免疫組化封片用中性樹脂或者中性快乾膠都可以啊，AEC顯色的用水溶性的封片劑就可以，免疫熒光的話需要專門的防脆變的封片劑或者用甘油也行（但是保存時間很短）。

免疫組化是一個經驗養成型實驗，實驗時最好有個貼心的師弟師妹當助手，做實驗之前把該用到的東西都悉心準備一下，在腦海中熟悉一下流程。每一個步驟的材料選擇都有很多依據，這需要我們經常看看大家分享的經驗帖增加基礎知識儲備，這個對於實驗室大牛得養成有很大的幫助，祝你大功告成！