乙烯信號簡史 | 乙烯信號開山之作：受體ETR1的鑒定

來自專欄菜鳥學飛記

李白在《蜀道難》中有「劍閣崢嶸而崔嵬，一夫當關，萬夫莫開」的詩句廣為流傳。在信號通路中，受體是激素分子引起細胞內部反應的第一道關卡。它就好比那當關的勇士，不攻克這一關，任它有千軍萬馬，細胞內也仍是風平浪靜，沒有絲毫反應。由此可見，受體在信號轉導通路中的關鍵性作用。

我們在上一講中提到過，1988年Bleecker等人在Science上報道了一個乙烯不敏感突變體，當用乙烯處理時，它無法表現出正常的「三重反應」，如鶴立雞群一般，高傲地俯視著腳下的野生型，並且在其生長發育的各個時期，所有組織和器官都表現出乙烯不敏感的表型。另外，突變體的乙烯結合能力也大大降低。基於以上結果，作者推測，ETR1很可能在乙烯信號的早期發揮作用，並且可能作為受體發揮作用。

1993年，Elliot M. Meyerowitz實驗室和Bleecker合作，在Science上發表了一篇文章Arabidopsis Ethylene-Response Gene ETR1: Similarity of Product to Two-Component Regulators。他們通過染色體步移（Chromosome walking）的方法，成功克隆到了ETR1基因。ETR1位於一號染色體的末端，編碼了738個氨基酸。序列比較發現，和野生型比，etr1-1突變體中ETR1基因的N端一個鹼基的替換導致氨基酸發生C65T的突變。

對於ETR1表達模式的分析發現，該基因在擬南芥的根、莖、葉、花和幼苗中都有表達，並且不存在可變剪切。此外，乙烯處理不影響ETR1 mRNA的表達。以ETR1基因片段和擬南芥基因組雜交，可檢測到多個片段，說明擬南芥基因組可能編碼多個和ETR1序列類似的類似基因。在此後的研究中，科研工作者們慢慢揭示了乙烯受體家族複雜的功能分化，我們後續再講。ETR1蛋白分析結果表明，其N端沒有發現保守的結構，但是C端和參與原核生物信號轉導的雙組份系統具有很高的相似性，暗示著它們可能具有相似的作用機制。

將etr1-1基因組序列轉化到擬南芥中，可引起轉基因黃化苗出現乙烯不敏感的表型，而轉化正常ETR1基因的轉基因植株的乙烯反應正常，說明etr1-1突變體的表型確實是由於ETR1基因的突變導致，這就敲實了ETR1在乙烯信號中的功能。

1995年，BLeecker實驗室報道，在從擬南芥中提取ETR1蛋白時，提取出來的蛋白的大小總是為147kD左右，而根據基因的CDS預測的蛋白大小是79kD左右，二者存在著約兩倍的關係。同時，當從異源表達ETR1的酵母中提取蛋白時，也出現類似的情況。可是，當用還原劑二硫蘇糖醇處理後，蛋白大小即可變為79kD，說明ETR1蛋白可能通過二硫鍵形成二聚體。將ETR1蛋白分段研究發現，其N端參與了二聚體的形成。將N端的半胱氨酸分別進行點突，發現第4位和第6位的半胱氨酸介導了二聚體的形成。

1999年，Bleecker實驗室再次在Science上發文A Copper Cofactor for the Ethylene Receptor ETR1 from Arabidopsis，報道了銅離子可作為輔助因子和ETR1的N端結合，影響ETR1與乙烯的親和性。另外，文章中還揭示了etr1-1突變的分子機制：etr1-1中的點突變導致蛋白無法和銅離子結合，進而導致和乙烯的親和性降低，無法識別和傳遞乙烯信號，導致乙烯不敏感的表型。

雖然ETR1基因早在1993年就已經被克隆了，但是限於當時的技術手段，ETR1蛋白的亞細胞定位一直是個不解之謎。通過蛋白結構分析發現，ETR1 N端含有一個跨膜結構域，但是序列分析並未為其亞細胞定位提供任何可參考的信息。直到2002年，G. Eric Schaller實驗室在THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 雜誌上發表題為Localization of the Ethylene Receptor ETR1 to the Endoplasmic Reticulum of Arabidopsis的文章，綜合使用了雙水相萃取、蔗糖梯度離心和免疫電鏡等技術，確定ETR1蛋白主要定位在內質網上，該定位主要由其N端決定。並且，乙烯的結合併不會改變ETR1的亞細胞定位。

看完ETR1的研究歷史，不僅感慨，小小的一個基因，竟然需要多個實驗室合作，花費了近十年的時間才研究清楚它的基本功能。以今天的觀點來看，簡直有點不可思議。歸根到底，主要原因是當時的實驗方法和實驗工具還比較落後。再看看我們現在的科研環境，要做某一方面的研究，成熟的體系都是現成的，這就大大加快了我們的研究進程。

當然，凡事有利就有弊。上世紀末，克隆出一個基因就能發個CNS級別的文章，而現在我們即使把功能做得非常深入，能發個CNS的子刊就不錯了。唯一不變的是，每一篇文章背後，都蘊藏著科研人員大量的心血和汗水。所以，當我們讀每一篇文獻時，請心懷敬畏。

【參考文獻】

Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., & Kende, H. (1988). Insensitivity to ethylene conferred by a dominant mutation in Arabidopsis thaliana. Science, 241(4869), 1086-1089.

Chang, C., Kwok, S. F., Bleecker, A. B., & Meyerowitz, E. M. (1993). Arabidopsis ethylene-response gene ETR1: similarity of product to two-component regulators. Science, 262(5133), 539-544.

Schaller, G. E., Ladd, A. N., Lanahan, M. B., Spanbauer, J. M., & Bleecker, A. B. (1995). The ethylene response mediator ETR1 from Arabidopsis forms a disulfide-linked dimer. Journal of Biological Chemistry, 270(21), 12526-12530.

Rodr?guez, F. I., Esch, J. J., Hall, A. E., Binder, B. M., Schaller, G. E., & Bleecker, A. B. (1999). A copper cofactor for the ethylene receptor ETR1 from Arabidopsis. Science, 283(5404), 996-998.

Chen, Y. F., Randlett, M. D., Findell, J. L., & Schaller, G. E. (2002). Localization of the ethylene receptor ETR1 to the endoplasmic reticulum of Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry, 277(22), 19861-19866.

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