疏肝益腎方對人乳腺癌TAM耐葯細胞株的作用機制分析,腫瘤學論文---學術堂

　　乳腺癌是全球女性最高發惡性腫瘤,死亡率僅次於肺癌,位居第二[1].無論國內、國外,每年激素受體陽性乳腺癌患者的比例均佔全部乳腺癌患者的一半以上.針對此類患者的首要治療是內分泌治療.然而,在內分泌治療過程中,原發的內分泌治療抵抗以及藥物使用時間過長產生的獲得性耐葯,嚴重影響了乳腺癌患者的遠期治療效果.因此,對內分泌耐葯的研究已引起越來越多學者的關注,成為當今腫瘤研究的熱點之一.疏肝益腎方是我科幾代中醫名家總結出來的治療激素依賴性乳腺癌的有效方劑,由柴胡、女貞子等合 "理沖湯"組成,具有疏肝益腎,調理沖任之血 ( 活血) 的功能,攻補兼施,祛邪不傷正的作用.本實驗就疏肝益腎方對人乳腺癌 TAM 耐葯細胞株 ( MCF-7 TAM-R) 的作用及作用機制進行了初步探索.

　　1 材料與方法

　　1. 1 細胞株 MCF -7 TAM -R: 對三苯氧胺耐葯的乳腺癌 MCF-7 細胞,由 Georgetown University MedicalCenter 的 Clarke 博士惠贈.

　　1. 2 實驗藥物 疏肝益腎方藥物組成: 黃芪、白朮、山藥、三棱、莪術、柴胡、白芍、女貞子、仙靈脾、海藻、甘草、山慈姑、穿山甲、全蠍、蒲公英、紫草、白花蛇舌草.藥品購自廣安門醫院 ( 各葯樣品均需經品種鑒定,註明學名,用藥部位、採集地點和季節) ,水煎劑由廣安門醫院煎藥室製備.枸櫞酸他莫昔芬片購自揚子江葯業集團有限公司( H31021545) ,由廣安門醫院西藥房提供.

　　1. 3 實驗動物 成年 SPF 級雌性同種 SD 大鼠 ( 體重 230g 左右) 30 只,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號: SCXK ( 京) 2012 ~0001,於我院動物中心飼養,清潔級.

　　1. 4 實驗試劑與設備 PBS 緩衝液、Cell CountingKit-8 試劑盒 ( 碧雲天) ; DMEM 無酚紅高糖培養基、胎牛血清、三苯氧胺 ( 4-hydroxytamoxifen) 、0. 25%+ 0. 02EDTA 胰酶消化液 ( 美國 Hyclone) ; 牛胰島素、二甲基亞碸 ( DMSO) ( 美國 Sigma) .基因晶元依託上海其明信息技術有限公司代為檢測.恆溫微孔板快速振蕩器由江蘇海門其林貝爾儀器製造有限公司生產; 多功能酶標儀由美國 Biotek 公司生產.

　　2 實驗方法

　　2. 1 細胞培養 將 MCF - 7 TAM - R 細胞用無酚紅DMEM 培養液 ( 含 10% 胎牛血清,青黴素、鏈黴素分別 為 100mg /L、0. 01mg/ml 胰 島 素、10-7mol / LTAM 溶液) 中,在 37℃ ,5% CO2,飽和濕度條件下培養.倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁情況,生長狀態良好,待其鋪滿瓶底 70% ~ 80% 時,以 0. 25% 胰蛋白酶消化傳代,隔日換液.

　　2. 2 大鼠含葯血清製備 ①雌性 SD 大鼠去勢: 大鼠常規飼養一周後,稱重,水合氯醛腹腔注射麻醉,劑量為 0. 35ml/100g.於大鼠背部切除卵巢, ( 手術方法參考李儀奎 《中藥藥理實驗方法學》[2]) 縫合後,頸部皮下注射青黴素,並在術後 3 天連續皮下注射青黴素,防止感染.術後大鼠恢復 1 周,開始灌胃.②將大鼠隨機分為疏肝益腎方高、中、低組、TAM 組以及空白組 5 個組,每組 6 只.中藥組以成人給葯的等效劑量的 4、2、1 倍來進行灌胃,TAM組以成人的等效劑量灌胃,陰性對照組以等量生理鹽水灌胃,連續5 天.於第5 天最後一次灌胃後 1 小時,經腹主動脈取血,常規離心製備血清,56℃、滅活 30 分鐘,過濾分裝後,-80℃保存備用[3].

　　2. 3 CCK8 檢測細胞抑制率 以對數生長期細胞 6 ×10^4個/ml 鋪 96 孔細胞培養板,24 小時後,將各組血清作用於細胞,以上各組的濃度均有 DMEM 培養液稀釋獲得,每組設 6 個平行孔,3 個調零孔,每孔200μl.分別在加藥後 24 小時、48 小時、72 小時、96 小時,每孔加入 20μl 的 CCK8 培養 1 小時,用酶標儀檢測各孔450 吸光度值 ( OD) ,按以下公式計算乳腺癌 MCF-7 TAM-R 細胞在各實驗條件、不同培養時間細胞抑制率,細胞死亡率 = ( 1 - 實驗組OD450 平均值 / 空白對照組 OD450 平均值) ×100% .結果如表 1. 2. 4 基因晶元檢測疏肝益腎方對 MCF-7 TAM-R 細胞的作用機制 根據2. 3 的實驗結果,提取加藥處理後 48 小時的 MCF-7 TAM-R 細胞的總 RNA,依託上海其明信息技術有限公司代為檢測.

　　2. 5 統計學方法 採用 SPSS 17. 0 軟體進行數據分析.結果採用 ( x-±s) 表示,組間比較用方差分析.P < 0. 05 為差異有統計學意義.

　　3 結 果

　　3. 1 CCK8 檢測含葯血清培養細胞後各組抑制率結果顯示: 與 TAM 組相比,疏肝益腎方三個劑量組對 TAM 耐葯細胞 48 小時,72 小時具有不同的抑制作用 ( P < 0. 05) ,尤以疏肝益腎方高劑量組 48 小時抑制作用最強 ( P < 0. 05) .見表 1.

　　3. 2 疏肝益腎方逆轉 TAM 耐葯的機制 疏肝益腎方對 TAM 耐葯細胞 MCF-7 TAM-R 有一定的作用,能夠抑制耐葯細胞的生長.為了明確疏肝益腎方對於MCF-7 TAM-R 產生這些變化的原理和機制,並結合中醫復方多靶點作用的特點,我們選擇基因晶元倍數法篩選差異基因的方法,對其進行研究.基因晶元結果共篩選出 1867 個差異基因,其中,表達上調的有 1436 個基因,基因表達下調的有 931 個基因.

　　對上調差異基因進行顯著性功能分析,結果發現疏肝益腎方參與血液凝固及蛋白轉運等113 項過程,對下調的差異基因進行顯著性功能分析,結果發現疏肝益腎方參與免疫應答及細胞凋亡的調控等 85 項過程; 而對上調差異基因進行 Pathway 分析,發現疏肝益腎方參與細胞周期調節以及核苷酸切除修復等 27項過程; 而對下調差異基因進行 Pathway 分析,發現疏肝益腎方參與 MAPK signaling pathway、VEGF sig-naling pathway 等 21 條通路的調節.

　　4 討 論

　　乳腺癌內分泌治療耐藥性的發生,嚴重影響著乳腺癌治療的遠期療效.因此探討乳腺癌內分泌治療耐葯的相關機制和延遲/逆轉乳腺癌內分泌治療耐葯的有效方法將具有重要的現實意義.

　　大量臨床前研究表明: 信號轉導抑製劑與內分泌藥物聯合使用可延遲或逆轉耐葯的發生,故而耐葯逆轉劑聯合內分泌治療將會成為未來治療的方向[4].很多靶向葯相繼開發進入臨床前研究,但在實際臨床中並未取得預想的效果.究其原因,主要是一: 耐葯的靶點、通路、網路盤根錯節,患者個體差異,非一兩個靶向葯的聯合能解決所有問題,而多靶點聯合在實際操作因其昂貴的價格和難以估計的副反應使可行性不強; 二: 耐葯通路、靶點仍未全部清楚,需進一步探索.

　　目前大量研究發現 MAPK 信號轉導通路與乳腺癌耐葯有一定的關係,其作用的機制可能是調控與耐葯相關的基因和蛋白表達,使其通過對該通路進行干預,提高腫瘤治療敏感性,從而逆轉耐葯.如Nguyen TV[5]等發現作用 β1 整合素及其下游效應器JNK 能夠抑制索拉非尼在三陰乳腺癌中耐藥性的發生.胡會永等[6]發現黃荊子的乙酸乙酯提取物 EVN-50 能夠抑制 MCF-7 和 MCF-7 TAM-R 細胞株的生長並誘導細胞凋亡,其作用機制可能與 AKT 和MAPK 信號通路的下調相關.馬小俞等[7]研究發現三苯氧胺耐葯細胞有較高的自噬水平,MAPK 信號通路參與了三苯氧胺耐葯.曾少波等[8]以 P38MAPK特異性抑製劑處理乳腺癌耐葯細胞 MCF-7/ADM 後,發現 P38MAPK 信號轉導途徑與乳腺癌耐葯密切相關,其機制可能為 P38MAPK 保護人乳腺癌耐葯細胞逃避細胞凋亡.本實驗採用疏肝益腎方作用乳腺癌TAM-R 細胞,發現 MAPK 信號通路的下調,這可能是其作用機制之一.

　　此外,VEGF 是刺激血管生成的因子中最具有代表性的細胞因子,影響著乳腺癌的侵襲、轉移等進程,同時與乳腺癌耐藥性的關係密切.宋玉仙等[9]研究表明,靈芝孢子油抑制人乳腺癌 MCF-7 細胞增殖和遷移,促進細胞調亡的作用機制可能與下調VEGF 和 Be 1 -2 / Bax 的比值有關.Soo Jin Oh 等[10]研究發現,TAM 耐葯乳腺癌細胞 MCF-7 TAM-R 的耐葯機制可能和 VEGF 的生成增加導致血管生成增加有關,而槲皮素通過抑制 MCF-7 TAM-R 細胞 VEGF的升高和 PIN1 ( 肽脯氨醯異構酶) 的表達,可能成為治療 TAM 耐葯乳腺癌的有效藥物; 進一步研究發現: PIN1 是 VEGF 介導的血管生成的主要調節因子,Kim J[11]報道了山葡萄提取的化合物之一的去氫黃柏苷 G 可以阻斷 MCF-7 TAM-R 細胞中 PIN1 介導的VEGF 基因的轉錄,從而提示去氫黃柏苷 G 治療TAM 耐葯乳腺癌的治療潛力.我們實驗發現,疏肝益腎方作用 TAM-R 耐葯細胞後,VEGF 通路的表達下降,提示 VEGF 通路可能是疏肝益腎方逆轉耐葯作用的另一機制之一. 中藥具有毒性小、安全有效、多靶點、藥理作用廣泛等優勢,在逆轉乳腺癌內分泌治療耐葯的研究中正受到越來越廣泛的關注.我們課題組前期臨床實踐證明疏肝益腎方聯合內分泌治療可以提高內分泌治療的療效,推遲進行化療的時間,減輕潮熱、骨痛等副反應,分層顯示其使最易耐葯的 LuminalB( ER+/PR+,HER2+) 型乳腺癌患者無進展生存期延長[12].實驗結果證實: 疏肝益腎方對他莫昔芬耐葯乳腺癌 MCF-7 TAM-R 細胞有抑制增殖的作用,其作用機制的發生可能與抑制 MAPK 通路、VEGF 通路等通路的表達有關.但因逆轉耐葯機制的複雜性及中醫藥的多靶點的作用特點,疏肝益腎方抑制MAPK 通路、VEGF 通路的機制需進一步驗證.

　　參考文獻

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