焦慮症海馬神經元損傷分子生物學機制及丹梔逍遙散干預的研究進展

焦慮症海馬神經元損傷分子生物學機制及丹梔逍遙散干預的研究進展

桂丹¹，富文俊²，虢周科³*

（1.廣州中醫藥大學，廣州 510000 2.廣州中醫藥大學中醫基礎理論教研室，廣州 510000 3.廣州中醫藥大學附屬深圳臨床醫學院，深圳 518000）

[摘要]關於焦慮症準確的發病機制目前研究比較一致地認為存在大腦海馬神經元的損傷，國外研究指出該損傷與蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)的調控、α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)的表達有重要關係，因此筆者認為PP2A活性的改變，可繼發α-syn異常表達，引起神經元的相關改變；那麼通過調控PP2A活性，可能引起α-syn蛋白C端129位的絲氨酸磷酸化/去磷酸化，從而調控GR活性，抗海馬神經元凋亡，達到修復受損海馬，抗焦慮的作用。本文綜述了近年有關蛋白磷酸酶2A，α-突觸核蛋白在焦慮症的分子生物學機制的研究進展和中醫藥復方丹梔逍遙散治療焦慮症機理的實驗研究進展。

[關鍵詞]焦慮症；丹梔逍遙散；海馬；α-突觸核蛋白；蛋白磷酸酶2A；綜述

Advances inMechanisms of Molecular Biology of Danzhi Xiaoyao San in Anti Hippocampal Neuronal Damage of Anxiety Disorder

GUI Dan1,FU Wen-jun2,GUO Zhou-ke3*

(1. Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000 China 2.Department of Basic Theory of Traditional Chinese Medicine(TCM), Guangzhou University ofChinese Medicine,Guangzhou 510000 China 3. Shenzhen TCM Hospital, GuangzhouUniversity of Chinese Medicine,Shenzhen 518000 China)

[Abstract]:It was widely accepted, in thepresent studies on the exact pathogenesis of anxiety disorders, that there is injuryof hippocampal neurons in brain. Overseas studies indicate that injury play animportant role in the regulation of protein phosphatase 2A (protein phosphatase2A, PP2A) and the expression of α-synuclein (α-synuclein). Therefore, weconsider that the change in the activity of PP2A may induce the abnormalexpression of α-syn, causing relative changes in neurons; so thephosphorylation / dephosphorylation of 129 points α-syn protein C-terminal9might be caused through regulating the activity of PP2A , then GR activityagainst neuronal apoptosis are further regulated, to repair damagedhippocampus, then to work in the anti-anxiety disorder. This paper reviews theresearch progress on the protein phosphatase 2A, α-synuclein in the molecularmechanisms of anxiety disorders and the progress on experimental study of themechanism of Chinese medicine compound Danzhi Xiaoyao San（DZXYS) in the treatment of anxiety disordersin recent years..

[Keywords] anxiety;Danzhi Xiaoyao San;hippocampal;alpha-synuclein;proteinphosphatase 2A;summary

焦慮症(anxietydisorders)又被稱為焦慮性神經症，是一種以焦慮情緒為主的神經症，主要表現為發作性或持續性的焦慮、緊張、驚恐不安等焦慮情緒，並伴有自主神經紊亂、肌肉緊張與運動不安等癥狀。而慢性應激是一種持久的過度應激,是導致許多慢性疾病特別是神經精神疾病的重要病因。相關研究指出應激是焦慮症產生的重要原因之一[[i]]。

焦慮症與外界環境和社會心理因素有重要的因果關係。應激導致腦內生理生化異常，特別是海馬損傷。大量研究表明，慢性應激或長期外源性糖皮質激素(glucocorticoid)處理可選擇性損傷海馬，使其神經細胞丟失,神經樹突萎縮,突觸點減少,糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor ,GR)減少，因而損傷海馬在HPA軸反饋抑制中的作用，最終導致焦慮症的產生[[ii]]，海馬則是應激損傷的敏感區。近年來α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn),蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是焦慮症的分子生物學機制中的研究熱點，有效調控PP2A活性，可能引起α-syn蛋白C端129位的絲氨酸磷酸化/去磷酸化，從而調控GR活性，對抗海馬神經元凋亡，修復受損海馬，抗焦慮的作用，這可能是焦慮症NR-GC/GR-HPAA這一信號通路的下游機制，文中重點綜述了它們在機制中起到的重要作用。

1 應激引起焦慮症海馬損傷的相關機制研究進展

應激(Stress)由加拿大心理學家Hans Selye於20世紀30年代提出，根據其對機體影響的性質及程度，分為生理性應激和病理性應激。病理性應激在醫學上又分為急性應激和慢性應激[[iii]]。各種應激源引起的應激反應長期存在，或者機體對應激的調整無效，繼發各種病理性改變，即慢性應激損傷。慢性應激損傷，對大腦的影響相當廣泛，包括局部結構形態，還有大範圍神經網路連接。比如導致海馬體積、外側和內側前額葉的皮層厚度發生異常。國外研究指出海馬可能是映射焦慮疾患之間異同的一個重要的大腦軌跡。焦慮和恐懼在功能上與海馬縱向軸線的不同細分相關聯：人體後部（嚙齒動物背側）海馬是參與記憶，通過連線與內側前額葉-內側壁層默認模式的網路，而前壁（嚙齒動物腹側）海馬通過連接帶邊緣，前額葉迴路參與焦慮[[iv]]。

Dias等[[v]]研究指出由應激所致的焦慮存在海馬神經元 損傷，如神經母細胞和樹突分支減少，這種海馬神經可塑性的變化可能是焦慮症發生機制的重要環節。他的研究結果顯示血清皮質酮水平升高，GR表達降低；新生神經元的數量減少，腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和樹突的表達增加；γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid,GABA）在海馬的低比率釋放，脊柱密度的增加，這可能是由高皮質酮觸發的海馬區神經母細胞和樹突分支的減少的一種代償性機制。有人建立慢性強迫游泳的應激模型，發現大鼠的海馬結構明顯受損。研究表明, 海馬在焦慮、恐懼的調節中發揮重要作用，海馬整個結構或背側損害導致大鼠活動過度，焦慮增強。有研究[[vi]]已表明4周強迫游泳引起海馬結構的損害，海馬區的神經細胞對應激的破壞作用最敏感。在應激過程中，海馬參與整合感知的信息、解釋環境信息的意義以及調控生物體的行為和神經內分泌反應[[vii]]。多項研究提示應激可導致大腦特定部位、尤其是海馬區的神經元萎縮。

Α-突觸核蛋白的異常聚集，細胞凋亡，導致海馬神經元損傷，是近年來國內外研究海馬神經損傷和神經變性疾病的熱點。本文重點探討了其對焦慮症海馬神經元的損傷調節可能的作用機制。

2 α-突觸核蛋白與海馬神經元損傷的關係

2.1α-突觸核蛋白生物學功能 α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)是一種中樞神經系統突觸前表達的可溶性蛋白，由140個氨基酸殘基組成，分子量19 kDa，結構相對保守，主要呈囊泡結合型或膜結合型狀態，α-syn的氨基酸序列通常被分成 3 個區域：N端(aa 1～60)含有KTKEGV重複序列，易形成兩性α-螺旋，類似載脂蛋白的脂質結合區域，是介導α-syn與脂質膜結合的區域；中部NAC(Non-myloid component)區(aa 61～95)的疏水區域易形成β片層結構，在體外極易聚集且可促進全長α-syn的聚集；C末端(aa 96～140)主要由酸性氨基酸組成，帶有大量負電荷，具有較強的親水性。環境或基因的改變極易引起α-syn發生錯誤摺疊，同時其二級結構可因環境的改變而出現動態變化，蛋白質出現寡聚體，纖維性蛋白質逐漸增多，因主要位於神經突觸和細胞核膜而得名。研究共發現200多種與突觸核蛋白基因同源的蛋白質,統稱為突觸核蛋白，分為A,B,C 3種類型，只有α-syn與神經損傷疾病有關[[viii]]。

到目前為止，還沒有全面地認識α-syn的生物學功能，但是現有資料至少表明α-syn具有以下幾種功能：調節突觸的可塑性、整合突觸前信號、調節突觸處的多巴胺含量、調節小膠質細胞活性、熱休克蛋白樣作用、參與脂代謝調節[[ix]]。

2.2α-突觸核蛋白的異常聚集可導致海馬神經元損傷 近年研究發現，α-syn基因突變及其結構和功能障礙與包括帕金森病(parkinson"s disease,PD)，阿爾茨海默病(Alzheimer"s disease,AD)在內的多種神經損傷疾病的病理機制密切相關，而且在焦慮症、抑鬱症等精神神經類疾病的發病環節中發揮重要作用。環境或基因因素均可引發α-syn的錯誤摺疊，二級結構改變形成寡聚體，導致蛋白功能紊亂，形成異常蛋白質。寡聚體可與突觸囊泡結合併產生小孔，增加囊泡的通透性，引起鈣離子內流、多巴胺外漏以及線粒體膜去極化，致使神經元死亡。它多以酸性的頭部和細胞膜結合，這種結構的特性使突觸核蛋白容易發生自我聚集。α-syn的表達和促進突觸核蛋白聚集體的形成使得突觸核蛋白逃避清除系統的控制, α-syn的高表達會導致線粒體功能失常[[x]]。最新研究[[xi]]表明廣泛的過表達α-syn可導致腦部特定區域的線粒體損傷。Rockenstein等[[xii]]通過創建許多合成的α-syn突變產生的物種，即其優先形成低聚物和增加α-syn介導的細胞毒性作用，發現了α-syn寡聚體在突觸的積累會導致神經退行性病變可能的機制，並通過比較小鼠模型之間的突觸損傷的圖案，其中積累生成的各種形式的α-syn，高表達α-syn的小鼠顯示突觸和樹突損失，突觸素和突觸囊泡的減少的水平，和行為缺陷等類似的改變，這些結果支持了積累低聚α-syn可以通過破壞突觸小泡介導突觸早期病理，造成海馬神經元損傷。

研究表明還有一種導致損傷可能的機製為腦內胰島素信號轉導障礙，葡萄糖利用減少，使突觸功能受損，異常聚集後，作為細胞內的一種毒性物質，可進一步擾亂正常的細胞功能，影響突觸傳遞效能。另外，α-syn的合成增加也可能是一種代償機制，以促進突觸前遞質的釋放，維持喪失的突觸功能，但這種代償性的保護機制並不能彌補其損傷作用。

2.3焦慮症存在α-syn的異常表達 Marxreiter等[[xiii]]研究證實α-syn的聚集損害海馬神經元的突觸功能和與在記憶障礙相關的神經元的功能，增加焦慮障礙。Chiavegatto等[[xiv]]通過調查α-syn同Lewis (LEW)和自發性高血壓(SHR)近交系大鼠，即焦慮遺傳模型，證實了α-syn在多巴胺神經傳遞的下調中非常重要的這一假設，確定了在品系不同的大鼠之間的α-syn基因的3"-非翻譯區(3"- UTR)有一種新的單核苷酸多態性。該核苷酸可能參與LEW和SHR大鼠之間α-syn的差異性表達。正是這種α-syn的差異性表達調節了大鼠焦慮樣行為。α-syn基因的多態性，與人類焦慮相關病症的脆弱性的可能性需要進一步深入研究。Rothman等[[xv]]研究發現α-syn的轉基因小鼠具有焦慮表型。國外也有一項關於PD的研究提出，過表達α-syn的轉基因小鼠表現出正常的條件和多巴胺β-羥化酶響應束縛應激異常的適應性反應的調控下，增加焦慮樣行為[[xvi]]。

3 PP2A與α-syn可能存在的關聯性

3.1PP2A的分子生物學功能 PP2A是一種絲/蘇氨酸磷酸酶(serine/threonine phosphatase,PP2A)，是真核生物體內存在最廣泛的蛋白磷酸酶之一，可以調控大部分細胞生命活動，在細胞生物學中起到重要的作用，包括細胞周期調節、細胞增殖與凋亡、細胞骨架動力學、細胞遷移等，能使蛋白質脫磷酸[[xvii]]。PP2A 全酶由65KD結構亞單位A(PR65亞單位)和36KD催化亞單位C以及一個可變的調節亞基B組成，其中A亞基作為支架蛋白連接B和C亞基獨具PP2A 的催化活性，調節亞基B決定了PP2A 的特異性、亞細胞定位以及全酶的催化活性，起到重要的調節作用。PP2A活性主要受全酶組裝和催化亞單位C翻譯後修飾的磷酸化和甲基化調節。眾多內源性底物，廣泛參與胞內受體信號傳導系統：如cAMP、cGMP、受體酪氨酸激酶、胰島素受體、細胞因子、神經酞胺、Wnt等信號傳遞系統，它也可與其他磷酸化酶和激酶組成大分子複合物的形式參與信號傳導調節。PP2A 全酶的大多數生物學功能是以調節亞基B 與底物的特異性結合為前提，再由催化亞基C使底物去磷酸化實現。在哺乳動物中，PR55亞基是由4個基因( A,B, C,D) 編碼的，它們在腦部的表達具有組織特異性，一系列神經變性疾病都涉及調節亞基PR55 的失調。國外的一項研究表明PP2A對底物蛋白的異常磷酸化，可導致海馬損傷[[xviii]]。

3.2 PP2A與α-syn是應激過程中信號通道的重要組成部分 PP2A在神經元變性疾病中起到關鍵作用，α-Syn是積聚在帕金森病和廣泛性焦慮症(generalized anxiety disorder,GAD)等其他神經變性疾病的病理標誌特徵磷酸化聚集體的關鍵蛋白質。它在絲氨酸129位點磷酸化修飾促進聚集和具有神經毒性，可能是治療靶標[[xix]]。Kang-Woo Lee等[[xx]]研究證實α-syn蛋白C端129位的絲氨酸磷酸化修飾可以引起PP2A的顯著激活,由PP2A的催化亞基羧基甲基化大大提高，增強PP2A甲基化的飲食α-Syn的轉基因小鼠，顯著地減少雙方的α-Syn的磷酸化絲氨酸129和大腦中的α-Syn的聚集。這些生化變化具有增強神經元的活動，增加樹突，減少星形膠質細胞和小膠質細胞的活化。這表明促進PP2A活性是可以調節絲氨酸129位磷酸化突觸核蛋白病。Saito等[[xxi]]深入研究發現高水平磷酸化狀態α-syn 可以引起神經元凋亡，損害中樞結構，且磷酸化修飾位點僅為C端129位的絲氨酸，這說明α-syn129位點磷酸化修飾在神經元凋亡過程中可能具有重要的作用。並且，Silvia Marina País等[[xxii]]研究則發現在應激狀態下， PP2A是應激信號通路的組成部分，對這種α-syn129位點磷酸化修飾進行調控。Roe等[[xxiii]]研究也發現PP2A在應激造成的海馬損傷修復中發揮了重要的作用。Yoshiki等[[xxiv]]研究證實可以通過調控PP2A以調節糖皮質激素受體(GR)及糖皮質激素(GC)的活性與敏感性。最近研究發現，在α-Syn 轉基因小鼠中，增加PP2A 活力可以直接使α-Syn去磷酸化而減輕毒性作用。並且該研究結果提示，提高內源性PP2A 活力能夠使α-Syn去磷酸化並顯著減少細胞損傷[[xxv]]。因此，干預PP2A 的活性將有可能為α-Syn引起的細胞毒性提供保護作用[[xxvi]]。由此說明PP2A與α-syn是應激過程中信號通道的重要組成部分，其對神經元的損傷與修復有著重要影響[[xxvii]]。最新研究[[xxviii]]，顯示抗神經變性藥物誘導的磷酸化Ser129的α-syn降低始終與激活蛋白磷酸酶PP2A的哺乳動物靶標相關聯。據此，我們推測，由PP2A介導，繼發α-syn異常表達，引起神經元的相關改變可能是焦慮症糖皮質激素及糖皮質激素受體-下丘腦-腎上腺皮質軸(GC/GR-HPAA)這一信號通路的下游機制，更有待進一步深入研究。

4 傳統醫學對焦慮症的認識及研究進展

4.1中醫的病因病機 中醫學中並無焦慮症之名，追溯古籍，對於焦慮症的認識基於秦漢，萌芽於晉唐，發展於宋，完善於金元明清。從臨床癥狀看，屬於情志病範疇，可能與郁證、驚、恐、驚、心悸、怔忡、不寐、臟躁、卑惵、百合病、燈籠病等病症有關[[xxix]]。至現代，各醫家基本達到共識，即認為焦慮症主要與外界環境刺激、七情內傷和個體素質遺傳因素有關。綜上所述，本病病位主要在肝和心，可涉及脾腎；主要病機為肝氣不疏，氣機郁滯，郁而化火，耗傷陰血，血不養心，臟腑虛弱，復加情志刺激，心主神明失司；或憂思過度，氣機閉塞不行，使臟腑氣機失調，累及心、肝、膽、脾、胃、腎，其中以肝、心、腎失調最常見，以氣鬱、火熱居於主要地位。

4.2中藥復方丹梔逍遙散治療焦慮症的現代研究 目前國內中醫藥復方在抗焦慮領域的研究主要注重於疏肝解郁、寧心安神、健脾補腎方面的復方，或取經典成方，或據臨床經驗加減，並結合在國外心理疾病的認知治療。其中丹梔逍遙散在臨床上廣泛應用於治療抑鬱焦慮等情緒失調病證，臨床效果確切[[xxx]]。丹梔逍遙散出自明代薛己的《內科摘要》，又名加味逍遙散，是在宋代《太平惠民和劑局方》逍遙散的基礎上加丹皮Paeoniasuffruticosa ,梔子Gardenia jasminoides 組成，具有疏肝健脾、和血調經功用，主治肝脾血虛，化火生熱。薛紅、虢周科等[[xxxi]]臨床發現具有疏肝解郁清熱作用的丹梔逍遙散具有較好的抗焦慮作用。李寧等[[xxxii]]通過建立慢性焦慮應激大鼠模型，觀察行為學變化，並使用中藥丹梔逍遙散進行干預，發現丹梔逍遙散具有明顯的抗焦慮作用，但是其具體的作用靶點及通路未明確。也有研究[[xxxiii]]證實丹梔逍遙散具有顯著的神經保護作用。

徐志偉 [[xxxiv]^-][[xxxv]]對丹梔逍遙散抗慢性心理應激損傷的機理方面做了大量實驗研究，發現丹梔逍遙散能明顯抑制慢性應激狀態下HPA軸的過度激活，從而減輕應激造成的損傷，並通過大鼠群居接觸實驗和曠場實驗這兩種行為藥理實驗中用於篩選和觀察抗焦慮藥物的較為可靠的實驗方法，證實逍遙散和丹梔逍遙散均具有一定的抗焦慮作用，但以丹梔逍遙散作用更佳，並對丹梔逍遙散的四種提取物進行藥理學研究發現，丹梔逍遙散水提醇沉液部分具有明顯的抗焦慮作用。吳麗麗等[[xxxvi]]也通過研究證實丹梔逍遙散及其提取物可以通過影響下丘腦CRH,血漿CORT水平參與對慢性心理應激反應的調控。有研究表明[[xxxvii]]丹梔逍遙散可以通過抑制慢性應激大鼠海馬神經元細胞中GR的表達，促進受損海馬結構修復。郭曉冬等[[xxxviii]]也證實可以通過調節海馬內GR和MR的蛋白表達，使海馬內GR和MR之間的比例關係均衡而起到治療改善情緒病的作用。蔡大勇[[xxxix]]通過動物實驗及細胞實驗發現丹梔逍遙散可以使大鼠的神經元細胞變性壞死、膠質細胞增生、血管壁扭曲增厚等病變減輕，並使神經細胞突起內的病變明顯好轉，腦血管內皮損傷減輕、基底膜完整、膠質細胞足突規則。證實丹梔逍遙散可通過調整代謝、恢復功能、維持結構而防治神經元損傷，可以減輕自由基損害、促進軸漿運輸、維持遞質平衡和提高機體適應能力等機制產生疏肝理氣、祛邪扶正的防治作用。據此，我們提出假說，由PP2A介導，繼發α-syn異常表達，引起神經元的相關改變可能是焦慮症GC/GR-HPAA這一信號通路的下游機制，這是我們下一步研究工作的重點。

5結語

近年來關於精神神經疾病很多研究的在中樞單胺類神經遞質代謝、神經內分泌系統紊亂、信號轉導系統、基因組學、蛋白質組學等基礎上，展開具有中醫藥特色的相關科研，取得了不少成果。綜上所述，結合國內外研究的前期成果，提出科學假說如下：疏肝解郁清熱方丹梔逍遙散可通過有效調控PP2A活性，引起α-syn蛋白C端129位的絲氨酸磷酸化/去磷酸化，從而調控GR活性，抗海馬神經元凋亡，達到修復受損海馬，抗焦慮的作用。這可能是焦慮症NR-GC/GR-HPAA這一信號通路的下游機制。目前α-syn及PP2A參與焦慮症的具體作用機制研究較淺，尤其需要採用大量動物實驗去深入研究。目前已預測和驗證了一些焦慮症發生的分子生物學機制，需要進一步大力嘗試。

[參考文獻]（略）

[責任編輯 鄒曉翠]

發表於2015年5月第9期