癌症免疫療法中的慢病毒載體

癌症免疫療法領域中的基礎科學進步在臨床上產生了多個取得成功的療法。這些療法中的很多需要將基因插入細胞中以直接殺死它們或是重新指導宿主細胞以誘導有效的免疫反應。其他類似的療法工作還有通過改造效應細胞以提高靶向性以及加強對腫瘤細胞的殺傷。最初使用γ-反轉錄病毒進行的研究結果前景可觀，但是集中於可能發生插入突變的安全性問題凸顯了對於發展其他備選的基因載體的需求。已經確認了慢病毒載體（LVs）可能時更有效和更安全的備選運輸載體。LV現在被用於包括癌症在內的多種不同類型的內生和獲得性疾病的臨床試驗中。本綜述會討論關於LV的只是和以這種病毒載體為基礎的運輸載體在癌症免疫治療中的應用。

癌症免疫療法指的是為了根除腫瘤細胞而利用免疫系統的療法。體內的免疫細胞本來就有識別和攻擊惡性細胞的機制；但是，腫瘤細胞經常會採取針對這些機制的反制措施來使其失效。免疫療法旨在通過多種不同方法來加強和補充這些自然反應，其中包括抗體和細胞因子療法、癌症疫苗和過激細胞輸注。這些療法中的一些需要對病人的細胞進行基因改造，或者直接殺傷腫瘤細胞或者誘導免疫反應或提高其靶向和細胞毒性。為了能將這些基因療法應用於臨床，一個能安全而有效的導入轉基因的可靠方法至關重要；到目前為止已經研究並檢測了很多方法。

使用γ-反轉錄病毒（又名腫瘤病毒）將特異性的T細胞受體輸送到淋巴細胞以治療黑色素瘤是第一個將經過基因改造的免疫細胞用於癌症免疫療法的臨床試驗。在這項公佈於2006年的工作之後，很多不同的癌症免疫療法方案應用了多種基因傳輸方法。應用了包括病毒和非病毒的多個系統。重組γ-反轉錄病毒仍然是一個流行的選擇；但是，慢病毒載體（LV）已經成為另一個潛在的更為安全和有效的選擇。到2014年為止，19.2%的基因療法試驗中使用了γ-反轉錄病毒。使用LV的目前僅佔到公開和歷史試驗的3.5%，但是，這個數字正在增長。

其他常用的病毒基因傳輸的選擇包括重組腺病毒（Ad）以及腺相關病毒（AAV）。Ad載體可以產生很高的滴度，但是他們會引發多餘的免疫反應並且由於不能整合進宿主基因組而限制了持久的轉基因表達。已知野生型AVV優先整合於基因組的一個位點，但是重組版本的AAV整合的頻率不高。除此之外，AAV的包裝容量較小，限制其可攜帶的轉基因的大小。γ-反轉錄病毒和LV都能有效的將其DNA插入到宿主基因組中，因而可以進行轉基因產物穩定和長期的表達，而這也是為何這些載體會經常被選來應用在直接針對癌症免疫療法中。

LV屬於反轉錄病毒科。但是其具有比γ-反轉錄病毒更為複雜的基因組。所有的反轉錄病毒都含有病毒感染和複製所必須的基礎基因。這其中包括編碼結構蛋白的gag基因，編碼酶蛋白的pol基因以及編碼包膜糖蛋白的env基因。LV還具有病毒複製必需的rev和tat基因以及附加基因vif，vpr，vpu和nef。Malim和Emerman對這些附加基因的功能進行了綜述。結構蛋白對於病毒核心內RNA周圍的結構包裝至關重要。病毒核心內含有兩個拷貝的相同RNA以及和核衣殼蛋白結合在一起的整合酶、反轉錄酶以及蛋白酶。核心的外部，存在一層能與外層脂膜相互作用的基質蛋白。由env編碼的糖蛋白鑲嵌於此外層中。

病毒的感染起始於由env編碼的糖蛋白與細胞膜受體結合之時。以LV為載體的基因療法中應用最廣泛的包膜蛋白取自水泡口炎性病毒，使得病毒通過與LDL受體和類似的家族成員結合而具有廣泛的親嗜性。結合事件的發生使得病毒與細胞發生融合。在結合之後，病毒內容物被傳輸進細胞。一旦進入細胞，病毒就解包裝並將核心組分釋放進胞漿。這其中包括單鏈RNA基因組，它會被轉化為cDNA並被運輸進細胞核。而另一方面，LV還具有其他特性，包括核心DNA擺動和其他未定因素，使其DNA可以通過完整的核膜。γ-反轉錄病毒和LV都將其DNA（這時都是雙鏈）整合進宿主基因組，然後利用宿主的機制將其基因轉錄回RNA。一旦完成複製並回到胞漿，來自野生型反轉錄病毒的病毒RNA被翻譯並被包裝進一個新的病毒顆粒中，然後以出芽方式離開細胞完成生命周期。

為了能被應用於基因療法中，對LV基因組進行了幾項改變以最大化安全性。這些改變被歸納為三次更新換代。在最新的第三代系統中，病毒基因組組分被分裝進一個包裝質粒、一個傳輸質粒以及一個包膜質粒，然後被轉染進HEK293T細胞（主要）進行複製。包裝質粒中含有所有病毒複製中需要的反式作用因子。這其中包括結構和酶蛋白的基因gag和pol，還有病毒調節基因rev。或者，可以用第二個包裝質粒表達rev，這就生成了一個4質粒系統。傳輸質粒包含感興趣的轉基因以及必需的順式作用元件，諸如psi (Ψ) RNA包裝信號，以及3』端和經過改造的5』端LTR元素。經過改造的5』LTR用一個組成型激活的不依賴於tat的啟動子替換了內源性的HIV啟動子，從而使得包裝質粒中可以不必攜帶tat基因。編碼包膜的蛋白由一個單獨的質粒表達，並可以通過一個被稱為假型的過程改變病毒的親嗜性。這個多質粒體系確保了只有轉基因和順式作用元件被轉導。非必要的病毒蛋白，諸如附加蛋白都被省略，這降低了免疫原性並且刪除這些編碼序列進一步降低了會產生具有複製能力的慢病毒的重組的發生可能性。

在第二和第三代系統中，又做出了進一步提升安全性的改變，其中包括會自我失活的傳輸載體的發展。這是通過切除傳輸載體3』端LTR中的U3區域，這個區域會在反轉錄之後遷移到5』端並發生整合，這樣就有效的把LTR啟動子活性最小化了。這項切除不會顯著病毒滴度，並且這項切除減小了啟動子的干擾從而避免因此造成不希望發生的轉基因沉默。將病毒基因分割進不同的質粒，以及實用自我失活的傳輸載體，進一步降低了產生具有複製能力的慢病毒的可能性。

除此之外還進行了其他優化載體系統的改造。這其中包括加入一個中心嘌呤帶，這可以提高整合前複合物向核內的轉運；而一個土撥鼠乙型肝炎轉錄後調節元件可以起到加強轉基因表達的作用。這些特性的同時作用提高了轉導效率以及轉基因表達。細胞特異性或可誘導的啟動子的使用也能成為一個有效的工具。細胞或組織特異性的啟動子試圖將轉基因靶向到特異組織進行轉錄，例如腫瘤細胞，其目的在於減少脫靶效應。可誘導啟動子的加入使得我們可以通過給予諸如四環素之類抗生素來在必要時打開和關閉基因的表達。在癌症的免疫療法中，這使得帶有整合了前病毒的免疫細胞在必要時提供抗癌治療，而減少永久性的轉基因表達，後者會帶來希望之外的副作用。

儘管對這個傳輸系統進行了改變和優化，對於LV的安全性的擔憂始終存在。其主要原因就是潛在的插入突變。第一個使用γ-反轉錄病毒具有明確療效的基因療法是一種針對兒童X1型嚴重聯合性免疫缺陷症的療法。不幸的是，在治療後，有幾位病人因為基因治療而患上白血病。反轉錄病毒生命周期中的基因組整合步驟是一種非靶向插入，因此存在整合進生產調節位點的可能性。已經確認了一系列前病毒可能插入的「熱點」。已經測定γ-反轉錄病毒的插入大約有21%的可能性發生在「熱點」，而這些位點集中於原癌基因和生長控制基因中。而LV被發現「熱點」插入較少，大約為8%，並且除此之外，這些熱點並不富集在影響原癌基因和生長控制基因的位點。LV轉導進骨髓細胞和肝細胞的體內研究表明插入主要發生在活性基因中，並不集中發生於與生長有關的基因中。除此之外，LV感染後沒有觀察到克隆擴增，表明載體誘導的的腫瘤風險較低。這些工作直到目前都肯定了相較於改造過的γ-反轉錄病毒，重組基因的LV是一種更為安全的替代品。

現在開發的另一個處理插入突變潛在問題的方案是發展非整合慢病毒載體（NILV）。在這種載體中，整合酶基因中進行了點突變從而阻止了基因組整合；取而代之的是，含有轉基因的質粒在細胞核內保持遊離。已發現這個策略與整合載體相比轉基因表達水平較低並且僅能短暫表達轉基因。對這個技術作進一步發展，通過使用鋅指核酶（ZFN）使得NILV DNA能在特異性的靶點進行同源重組，後者會在雙鏈上產生缺口以啟動同源定向的修復途徑。這個方法可以對基因序列進行靶向修復，降低插入突變的風險。轉錄激活樣效應因子核酶（TALEN）在功能上與ZFN相似，但是其DNA識別結構域的設計更為簡單和靈活。最近公開了一項研究的報告，針對編碼人體蛋白的基因構建了18740個TALEN。在臨床前研究中，現已表明NILV在癌症免疫療法中有效。它們可以被單獨使用，諸如在一個研究中NILV作為癌症疫苗被使用，也可以和設計者核酶一起使用，已表明將其和ZFN一起使用在破壞內源性TCR基因同時表達腫瘤特異性的TCR以提高有效性和安全性。

利用CRISPR/Cas系統的基因組編輯是一項新近發展用來產生位點特異性雙鏈缺口的方法，此系統使用RNA分子來識別切割位點並用一個Cas核酶來產生切口。一項使用LV和CRISPR系統進行位點指向性突變的在小鼠胚胎幹細胞中進行的功能缺失篩查表明，這套組合能比RNAi更有效的抑制基因表達。一項由Gilbert等在2013年進行的使用LV和人體細胞的研究中，失活的Cas9和調節性蛋白融合併並能在RNA的引導下進行基因的定向抑制或失活。已發現CRISPR/Cas在轉導後14天內能持續穩定的表達。

儘管前述技術很有前景而可以做進一步開發，仍需要克服一些問題。由於相同或同源DNA序列造成的脫靶突變是ZEN和TALEN系統的一個風險，也許其風險還高於CRISPR/Cas系統。認真的選擇靶位點，控制CRISPR/Cas的劑量可以有益於減少風險，為了解決這一問題還開發了另外的選擇，諸如將Cas9更換為切口酶。ZFN切口酶的開發已經得到解決。這些系統的效率已經得到優化，至於CRISPR/Cas，對於下游原間隔連接花式的要求限制了可以作為靶點的位點，而因此不依賴於原間隔連接花式的系統會有所裨益。這些系統在原代細胞中的效率是阻礙其被廣泛應用的另一個障礙。最終這些系統的轉運模式還在發展之中。這些轉基因的大小是可插入片段大小有限的病毒轉運載體的一個限制因素。LV是ZFN和CRISPR/Cas系統的一個切實可行的選擇，但是已表明TALEN系統可能由於轉基因運輸後高度重複的TALEN序列具有發生重排的傾向而與LV無法兼容，因此對於轉運技術的進一步發展至關重要。

細胞命運控制（又名「自殺」）元素為減緩細胞和基因療法產品給葯後可能發生的不良事件提供了途徑。這個方法包括使用可以在為病人給葯後選擇性根除被轉導細胞的轉基因序列。這些系統經常是建立在一種酶的特異性突變形式的基礎上的，將其轉基因序列和治療部分一起轉導進細胞。這些經過改造的酶賦予細胞將無毒的前葯轉化為細胞毒化合物的能力，最終清除掉該靶細胞。

經典的單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）cDNA是一個被廣泛使用的自殺系統，它可以將前葯更昔洛韋（GCV）轉化為具有細胞毒性的GCV-三磷酸。此系統被成功應用於臨床實驗中，但是已發現對於靶細胞的清除並非總是完全有效。這可能是由於GVC-TP的細胞毒性是細胞周期依賴性的，因此對非分裂細胞無影響。還有一種可能就是該通路的下一個酶（鳥苷酸激酶）的底物動力學很差和/或限速步驟有問題妨礙了對靶細胞完全清除。這種不完全的清除使病人承受了殘留的不良效應。此外，GCV常被用於幹細胞移植病人以預防和治療巨細胞病毒感染，因此要從包含此安全性系統的刪除方案中排除一些病人。

針對與HSV-TK有關的缺陷，本實驗室發展了兩種細胞命運控制系統。即所謂的TMPK和dCK細胞命運控制系統。兩個系統都建立在對人體酶的極小修改基礎上，預計對於病人僅有很低的抗原性。除此之外，它們所激活的前葯的安全性和葯代動力學狀況都很好。經過改造的TMPK能激活前葯疊氮胸苷成為具有細胞毒性的疊氮胸苷三磷酸，造成細胞凋亡。這是通過在表達TMPK突變體的細胞中線粒體內膜的電勢差缺失以及半光天冬酶-3的激活造成。此外，我們最近還表明了TNPK突變體可以有效的和細胞表面標記在結構上融合，因此直接將載體滴度和次方法的清除功能聯繫在一起。本實驗室發展的第二個系統是以人dCK為基礎的。此酶是核酸合成補救通路的關鍵激酶。dCK的結構上設計了多個活性位點，使其可以激活多個臨床上相關的前葯，但是我們的工作主要集中在兩個葯上：BVdU和LdT。這個系統具有高度選擇性，因為野生型dCK無法快速轉化這些化合物。由於有多個前葯可供選擇，可以在根據病人個體設計的基礎上選擇效應分子化合物。

對免疫系統的控制還有細胞免疫的特異性，正在成為對抗癌症的重要策略。回顧這一治療/研究領域的多變歷史，最近正在發生認知和事實雙重意義上的復興。通常成功的治療方案中包含兩個方面：提供一個與腫瘤相關的靶點讓免疫系統識別並且建立方法來激活或重新定向宿主免疫反應。在這裡我們會總結為了啟動和促進癌症免疫療法，LV是如何被用來對癌細胞和免疫細胞進行基因工程改造的。

多種策略都被用來開發抗癌症疫苗。它們的目標在於刺激包括細胞毒性T淋巴細胞（CTL）在內的Th1反應，來選擇性靶向並消除癌症。有一種細胞被專門用來促進抗癌疫苗療法的細胞，那就是樹突狀細胞（DC）。DC是一種職業APC，它獲取、處理並通過MHC I和II類分子向T細胞進行抗原遞呈。在進行這些時，DC能誘導包括CTL在內的Th1反應。當受到炎症信號刺激時，DC快速成熟、處理和遞呈抗原並遷移到次級淋巴器官中以誘導免疫反應。一些披露的研究中，疫苗的製備包括從病人身上獲得DC，然後在體外讓這些DC攜帶腫瘤相關抗原（TAA）。經過操作的細胞被會回給病人。這些荷載了的DC能向T細胞遞呈經過處理的TAA，因而誘導針對表達TAA的細胞的Th1反應（見圖1D）。實際上，目前為止僅有一個被FDA批准的由細胞介導的免疫療法就是一個DC癌症疫苗，Sipuleucel-T。Sipuleucel-T療法通過向病人的DC導入前列腺酸性磷酸酶（一種前列腺癌TAA）肽和GM-CSF來發揮作用。GM-CSF是一種刺激巨噬細胞產生和DC浸潤的炎症性細胞因子。這一組合成功的誘導了免疫反應，表現出中位數為4個月的生命延長。

但是荷載了肽的DC疫苗療法面臨幾個障礙。只能在在MHC上進行短暫的外源性腫瘤抗原遞呈，這妨礙了長期的免疫效果。除此之外，反應是MHC單倍型依賴的，因此每個病人需要個體化定製產品。還有就是選擇用於MHC複合物的荷載肽比較困難，在這個領域需要做進一步研究以優化方法。有一種可以越過多個障礙的方法就是用帶有完整的TAA cDNA的病毒載體轉到DC。現已證明該方法可以提供更為穩定的腫瘤蛋白表達，使得DC可以在很長一段時間內處理並以更為自然的方式向免疫系統遞呈抗原。

如前所述，DC通過MHC和T細胞的TCR之間的作用來向T細胞展示經過處理的抗原肽而完成遞呈。但是，此信號可能還不足以誘導T細胞反應。相反的，現已表明僅有此相互作用會導致T細胞無能化並死亡。在此相互作用的基礎上，需要在激活條件下的免疫突觸中更多的共刺激信號來誘導並優化細胞毒T細胞反應。細胞因子則作為刺激和極化T細胞反應的第三信號。現已使用LV來對DC進行基因工程改造以使其表達利於激活和/或釋放特異性細胞因子以極化T細胞。還有研究表明可以使用LV來沉默以PD-L1為代表的表達於DC的T細胞抑制性共刺激結構域，可以加速抗腫瘤免疫反應。此外，對能釋放可溶性PD-1或可溶性PD-L1對免疫突觸進行干擾的DC進行改造可以使一種激活性的共刺激結構域——CD80表達上調，並且顯著促進細胞因子中TNF-α和IL-10的組成。還有研究表明阻斷T細胞抑制性共刺激結構域的PD-1抑製劑還能加速激活的DC中的抗腫瘤免疫反應。另一個策略是利用LV調整胞內通路。利用LV基因工程組成型表達p38 MAPK通路中德活性蛋白成功的加強了抗腫瘤T細胞反應並延長了腫瘤小鼠的生存時間。該研究中作者表明p38的激活導致CD80、CD40和ICAM-I的上調，協助了DC誘導抗腫瘤的T細胞反應。這些是一些被開發用來加強DC疫苗抗腫瘤活性的策略。

病毒載體還能將來自病毒蛋白的共刺激信號導入細胞。這些共刺激信號可以幫助誘導免疫反應。例如本組的研究已表明與由腺病毒轉導的DC相比，由LV轉導的DC能引發不同的免疫反應，雖然兩者都通過基因工程表達了抗原HER-2。已表明由腺病毒轉導的DC刺激產生了CD4 和CD8 T細胞反應，以及更為耐用的體液反應。相反的，LV轉導的DC誘導以CD4 T細胞為主的反應，伴隨著更高濃度的IFN-γ分泌以及較低的體液免疫。這表明了病毒載體的選擇也對DC疫苗誘導的反應具有影響。因此，重要的不僅是選擇一個可用的TAA，還需要考慮針對每一個特異性的案例選擇最佳的運送載體。

LV的獨具特性使之成為一個具有吸引力的用於DC細胞轉導的病毒載體系統。如前所述，它們能在分裂細胞和非分裂細胞中提供穩定的轉基因表達並且基因毒性發生率較低。現已表明，並非依賴於假病毒的包膜而是依賴於進入細胞，LV轉導激活了DC釋放1型干擾素並干預了針對所攜帶抗原的免疫原性。進一步研究表明此效應的機制是TLR依賴性的。已經在臨床前小鼠模型中檢測了用LV轉導多種TAA的DC激發免疫反應的能力。某些TAA能誘導出較為持久的免疫反應，其中包括黑色素瘤抗原mTRP-2和MART-1，對包括Sca-2、GP38和細胞RABP1在內的多種肝癌TAA進行研究。TAA erbB2和PSCA被用來作為針對前列腺癌的靶標。所有這些由LV轉導的TAA都能幫助指導DC誘導出特異性的免疫反應，從而產生顯著的腫瘤抑制。

圖1、腫瘤免疫療法中慢病毒載體的應用

CAR：嵌合抗原受體；LV：慢病毒載體；TAA：腫瘤相關抗原；TCR：T細胞受體

儘管這類治療提供了潛在的收益，但是DC疫苗仍然有障礙需要克服。以DC為基礎的疫苗通常是自體來源的：在治療前需要從病人個體中獲取DC。但是，外周血中的DC數量有限。針對這一障礙的一個解決方法CD14 的單核DC前體細胞和CD34 的血或骨髓DC前體細胞，然後通過加入細胞因子和生長因子將其分為成熟DC。自從開發了這種方案，許多實驗室已經成功的用LV向CD14 和CD34 來源的DC中進行了轉導併產生了很高的轉基因表達。另外一個探索中的策略是使用由人誘導多能幹細胞（iPSC）和胚胎幹細胞誘導而生的DC。通過LV轉導的OCT3/4、SOX2、c-MYC和Klf4對取自供體的真皮成纖維細胞的人iPSC進行改造。然後這些多能和自我更新的iPSC分化成具有所需表達譜、形態學以及細胞因子分泌的功能性DC，使其具有誘導抗原特異性T細胞反應的能力。這些DC的功能性來源使得供臨床使用的大規模生產成為可能並能幫助規避不同病人之間的差異和復原等現有問題。

此治療模式所面臨的其他挑戰還包括體外製備疫苗的可用時間窗口有限。動力學研究表明攜帶抗原的DC壽命很短，這使得很難有效達成處理、抗原攝取和成熟。通過使用LV向DC轉導c-FLIPS、c-FLIPL、Bcl-XL和M11L的cDNA已經成功延長了DC的生存時間。這些基因編碼關於生存的因子，作用於內源性和外源性的凋亡通路。使用LV的優點在於會有助於提高DC疫苗的收益併產生更為持久的免疫反應而進一步延長患者的生存。

體外免疫接種研究的成功鼓舞了對直接接種攜帶編碼TAA cDNA的LV進行評價。對小鼠皮下注射LV導致對皮膚來源的DC進行直接轉導。這些DC隨後被運送到淋巴結以誘導T細胞反應並提供長期的抗腫瘤免疫。現已表明對小鼠的肌肉內和腹腔內注射可以導致有效的免疫反應。直接接種LV這一策略與前述體外轉導相比在概念上而言有更大的致突變風險，但是可以規避掉DC疫苗在運輸上的限制，包括針對每個病人都進行細胞的分離和擴增。對於直接注射LV進行腫瘤免疫接種的策略還需要進行更多的研究以評價其療效和安全性。

人造APC（aAPC）是另一種可以利用LV作為轉基因載體的癌症免疫療法形式。這些aAPC是用來加強T細胞的體外擴增的。aAPC通常通過細胞或磁珠表面表達的共刺激結構域和TAA來發揮作用。可以利用LV向白血病細胞轉導共刺激分子或細胞因子而將其轉變為aAPC。由於白血病細胞表面已經存在多種TAA，可以設計具有特異性分子的aAPC以便於優化T細胞激活和擴增。

通過利用LV轉導CD80和/或4-1BBL將白血病細胞系K562轉化為aAPC。這些aAPC能支持T細胞在不需要外源性細胞因子的條件下體外生長和長期擴增。在激活的APC、B細胞和單核細胞表面都發現了CD80，它為T細胞提供了一種共刺激信號，促進其激活和生存。4-1BBL則見於DC表面，是促進T細胞增殖、分泌細胞因子和細胞毒能力的共刺激結構域。作者進一步表明其K562來源的CD80 4-1BBL aAPC能在體外將T細胞擴增約10000倍，其中包括基因改造過的T細胞。此法超過了其他體外擴增方法，諸如通過磁珠和其他aAPC，10倍以上。此法有助於克服自體T細胞療法所面臨的最大問題：靶效應細胞的體外擴增受限。值得注意的是，該方法還造成T細胞的多克隆擴增，這對於希望效應細胞的功能和特異性保持平衡的過繼免疫療法很重要。

由於最近在臨床上取得的一系列成功，過繼傳輸經過基因工程的T細胞已經被推到癌症免疫療法的前沿。T細胞療法一個超過其他免疫療法的優點在於其能歸巢到腫瘤位點的能力。一旦它們抵達腫瘤位點並受到TAA的特異性刺激，就能增殖、存活並攻擊腫瘤。自體T細胞療法包括從病人身上獲取T細胞並選取在抗原選擇上具有良好親和力的高度抗原特異性的T細胞。然後這些細胞被激活、擴增並回輸給病人。儘管有記錄表明達成了目的臨床反應，這類療法仍然面臨著包括自然產生的抗原特異性T細胞的相對缺乏，T細胞突破耐受的能力不足以及將這些T細胞擴增至足夠數量。現已採用轉基因改造的T細胞來解決這些問題。T細胞經過改造以提高其識別、增殖以及殺傷特異腫瘤細胞的能力。此章節會涉及使用重組LV為載體進行基因改造的T細胞，其中包含的基因有異源性的TCR和嵌合抗原受體（CAR）。

TCR是由一條α鏈和一條β鏈組成的異二聚體結構，識別由MHC和經處理的細胞內蛋白組成的複合物。TCR與CD3信號複合物相關，是通過TCR激活T細胞的所必需的。因此可以從一個T細胞群中分離TCR並轉移到另一個中，現已開發了一種策略即從對特異性TAA具有高度特異性和活性的T細胞中獲取TCR並將其cDNA轉移到另一群從病人體內分離的外周血T細胞中（參見圖1B）。在具體操作中，希望被轉移的TCR同時還具有高度的腫瘤反應性和特異性。重組病毒載體的發展便於進行穩定和高校的基因轉移，使得本療法得以實施。

雙順反子LV的發展是一項革新。這使得表達TCR複合物的α和β鏈基因更為簡單，並因此使得LV成為TCR基因療法中的轉基因載體。很多使用LV轉導TCR的針對不同癌症的自體T細胞的臨床實驗正在進行中，其中包括一項以NY-ESO-1為靶點的治療食管癌的II期臨床試驗。還有多個以轉移黑色素瘤中的MART-1為靶點的試驗，其中包括一個聯合使用針對MART-1和遞呈MART-1的DC的I期臨床試驗。

TCR療法所面臨的一個潛在問題就是外源性TCR鏈和內源性TCR鏈組合產生了不需要的異源性TCR形式而造成的脫靶毒性。一個解決這種潛在問題的方法是使用設計者核酶干擾內源性基因。現已表明以TCR基因為靶點的ZFN可以有效的阻斷T細胞中的TCR表達。與未編輯T細胞相比，以LV為載體的Wilms腫瘤1抗原特異性TCR在經ZFN編輯的T細胞中純度顯著提高而脫靶效應顯著降低。這對於幫助增進以TCR為基礎療法的安全性和特異性具有良好的前景。

由於近期在CD19 B細胞惡性腫瘤臨床試驗上的成功，CAR開始大行其道。在美國，現在有超過20個正在進行或已經完成的使用CD19 CAR-T細胞治療多種B細胞惡性腫瘤的臨床試驗。最近還有很多以其他實體腫瘤和血液病中的TAA為靶點的CAR正在開發中。這些臨床前和臨床試驗使用了多種基因載體，其中包括γ-逆轉錄病毒和LV。

CAR被用作一種自體T細胞療法，通過在體外向病人T細胞轉到CAR序列。正如其名，CAR是由不同蛋白的多個不同結構域組成並被裝配成一個人工的受體。這些受體被設計定位在細胞膜，並且由胞外和胞內區域組成，其胞外區域被設計來和腫瘤細胞表面表達的特異性TAA結合。此區域通常由一個來自抗體的單鏈可變區域組成，識別並結合特異性的TAA從而使免疫細胞具有針對靶癌症細胞的特異性（參見圖1A）。胞內結構域的數量為1-3個，被設計用來激活/加強T細胞的細胞毒能力。胞內結構域能增加效應細胞的細胞因子分泌、增殖和持久性。這些結構域一般包括來自TCR的CD3ζ，以及CD28、OX40和/或4-1BB。通常為了直接參与適應性免疫反應的效應支會將CAR轉導進CTL，但是對於諸如NK細胞的輔助手段的使用也還在探索中，並且已經初見成效。

和其他任何療法一樣，CAR-T細胞也有自身的限制。因為CAR通常包含來自於鼠源性抗體輕重鏈的胞外結構域，他們可能具有免疫原性。這有可能導致它們在體內被清除，導致療效受到影響。除此之外，即使是由「人源化」抗體改造而來，它們仍是全新的融合多肽還是會產生免疫反應。還要注意的是，CAR只能識別胞外表達的TAA，但是TCR識別的由MHC處理過的蛋白則有可能是胞內來源的。這將在某種程度上限制CAR-T療法的潛在靶點的選擇，MHC非依賴性是一項重要的收益，因為癌症細胞能通過沉默其MHC表達來逃避免疫監視。繼續深入研究，作為二聚體的TCR和由內源性TCR組成的異二聚體可以產生脫靶效應。如前所述，將ZFN和TCR療法聯用時在消除不希望發生的脫靶毒性方面前景很好。

CAR療法還與某些風險相關。此療法的一個結果就是免疫反應增強，從而導致細胞因子風暴：多種細胞因子不受控制的系統性上調。細胞因子風暴，亦作細胞因子釋放綜合症（CRS），其烈度可以從發熱乃至於器官衰竭和死亡，因此是一個亟待解決的問題。有報道說，這些反應更多由於細胞回輸至病人體內這種給藥方式而非CAR改造的T細胞造成的。已經開發了一種方法在發生CRS之後的進一步發展，就是激活前述的細胞命運控制或「自殺系統」。通過iCasp9系統誘導細胞凋亡被用於臨床，成功的在同種異體細胞移植並快速逆轉移植物抗宿主病（GVHD）發生後將其終止。這類系統，諸如本組開發的dCK和TMPK系統，還有HSV-TK系統可以適用於以CAR和TCR-T細胞為基礎的療法。效應基因序列和治療基因一同被轉導進細胞，在給予前葯後可以終止細胞療法，阻止引起CRS和其他副反應的正反饋系統。

基因改造T細胞針對非腫瘤細胞靶點的結合是另一個問題。此問題的程度如何高度依賴於所涉及的TAA和scFv。通常選擇TAA是因為其在腫瘤細胞上的高表達，但是作為自身抗原它們也在普通組織上有低水平的表達。當TAA提供了某種生存優勢或是來源於共同的祖細胞時就有可能發生問題。例如，CD19在B細胞來源的惡性細胞上高水平表達，但是也出現在健康B細胞上。作為結果，B細胞再生障礙是這類CAR療法的副作用。在本案例中，與生存的增加相比勝過了B細胞短期清除的後果使得病人依從性較好。因此，選擇適當的TAA是CAR療法成功的關鍵。

為了確認新的TAA並雞西調整CAR療法的最佳親和力和持續時間，還需要進行進一步的研究。為了將此療法推廣到其他癌症類型，已經進行了將CAR療法應用於實體腫瘤。如何接近靶腫瘤細胞是一個問題。一些最近進行的研究還調查了通過mRNA電穿孔而非病毒載體轉導CAR的可能性。這樣會大大縮短CAR的表達持續時間，從而防治長期的CRS和/或限制腫瘤脫靶效應；但是此方案中為了誘導一次反應需要多次輸注CAR細胞。不幸的是，多次給葯會帶來諸如再生障礙之類副反應發生增加的風險。長期表達的收益，諸如使用LV能達到的，是單詞CAR改造細胞輸注即可達成很強的療效並長期防護癌症的複發和進展。

近年來的基因治療和癌症免疫療法中重組LV的應用越來越廣。LV的有效和穩定的轉導能力極其感染非分裂細胞的能力，使其優於其他整合病毒系統。儘管安全性（主要是插入突變）仍然是個問題，LV已經被用於一系列癌症療法諸如DC和癌症細胞疫苗還有TCR和CAR基因工程改造T細胞療法中。其中的一些已經在臨床上被證明是成功的，因此更多和更進一步的研究會跟進。

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