從骨科醫生到諾貝爾獎得主

作者：廖新化（美國貝勒醫學院幹細胞與再生醫學中心）

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2012年諾貝爾生理學與醫學獎授予了英國的John Gurdon爵士和日本的山中伸彌，以表彰他們發現分化的體細胞可以重編程為多能幹細胞。山中伸彌發現誘導多能幹細胞（induced pluripotent stem cell, iPS cell）的工作是在2006年發表的，之後iPS一直是生命科學的研究熱點。解析他當年研究的歷史背景、思維邏輯和實驗手段，對當今的科研人員具有借鑒意義。山中伸彌在研究中經歷的問題/趣事，多數的生命科學工作者也會遇到，因之山中伸彌還是一個毛蟲變蝴蝶的正面典型。中國現在還盛行規劃性科研，一些重大項目佔據了科研基金的多數比重；而且很多科研投入都面向國計民生，期待短期內對經濟活動有重要影響；對基礎研究、自由探索性研究的重要性理解不深。山中伸彌發現iPS是典型的小實驗室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有相當多的科學突破是不可預測的。如果中國有大批優質的小實驗室得到穩定的資助，那麼類似的科學突破就會隨機但是必然地產生。從這種意義上講，展示山中伸彌在研究過程中的這種隨機性和必然性，對科技管理者也是很有啟發意義的。

解析山中伸彌發現iPS的來龍去脈比較簡單，就是跟蹤他順次研究的基因：ApoBEC1-Nat1-Fbx15，直至他最後發現iPS。有趣的是他在順次研究這些基因的時候轉了兩次方向：ApoB是血脂蛋白，研究它的編輯酶ApoBEC1是為了調節血脂，但是卻意外發現過表達ApoBEC1的小鼠得了肝癌； 為了研究致癌機理，他 找到ApoBEC1的下游蛋白質Nat1，Nat1的敲除導致小鼠在胚胎期死亡，以及胚胎幹細胞在體外無法分化；於是他又開始研究胚胎幹細胞，找到許多胚胎幹細胞特異表達的基因，其中之一是Fbx15，最後用Fbx15敲除鼠建立assay （篩選方法/系統），幸運地篩選出了iPS。

山中伸彌念高中時迷上柔道，因為受傷經常上醫院，他在爸爸的建議下隨後考入國立神戶大學醫學部，準備以後作一名骨科醫生。大學畢業臨床實習期間，他發現自己對手術其實沒有什麼天分，別人做20分鐘的手術他兩個小時也未必完成；並且他覺得當醫生再有天分也只能幫助少數的病人，而醫學研究有成果的話通常可以幫助更多的病人，所以他的興趣轉向基礎醫學研究。在大阪市立大學博士期間，山中伸彌的主要工作是研究血壓調節的分子機理[1,2]。在研究過程中，山中伸彌對小鼠轉基因和基因敲除技術感到震驚，於是他在申請博士後位置的時候聯繫的都是利用這些技術的實驗室。

2 博士後階段-ApoBEC1

1993年，這位失敗的骨科醫生最後被加州Gladstone Institutes的Thomas Innerarity納入門下。Thomas實驗室研究的是血脂調節，跟山中伸彌博士期間的工作有點關係。山中伸彌的新課題是研究ApoB mRNA的編輯蛋白質ApoBEC1。ApoB是低密度脂蛋白的主要構成成分。ApoBmRNA可以被編輯酶ApoBEC1脫氨提前終止翻譯，形成兩種不同大小的蛋白質：全長的ApoB100和大約一半長的ApoB48。經編輯後的ApoB48在血漿中會被迅速清除。Thomas預測，在肝臟中過表達ApoBEC1，血脂可能降低；如果這個模型可行的話，也許未來通過基因療法可以幫助一些肥胖病人降低血脂。

山中伸彌一周7天地勤奮工作，花了6個月做成了轉基因鼠。有一天早上，幫他維護小鼠的技術員告訴他：「山中伸彌，你的許多小鼠都懷孕了，可是它們是公的」。山中伸彌說：「你不是跟我開玩笑吧？」他到老鼠房一看，果真有很多公鼠看起來懷孕了。他解剖了其中幾隻，發現原來是小鼠得了肝癌，肝臟腫大撐大了肚皮。ApoBEC1過表達後低密度脂蛋白是降低了，但是高密度脂蛋白卻升高了，同時還得了肝癌，這買賣不合算啊[3]。山中伸彌在一次講座中半開玩笑地總結了其中的經驗教訓：其一，科學是不可預測的；其二，不要嘗試在病人身上做新基因的治療；其三，也許最重要的是，不要相信導師的假說[4]。

Thomas對結果不能符合預期很失望，但是這個預期之外的結果卻勾起了山中伸彌的好奇心：究竟是什麼機理使小鼠得腫瘤的呢？好在Thomas足夠開明，他允許山中伸彌偏離實驗室的主攻方向，繼續探索ApoBEC1的致癌機理。可以想見，ApoBEC1過表達以後也可能會編輯ApoB之外的其它mRNA，找到這些mRNA也許可以解釋ApoBEC1為什麼能致癌。

由於已知ApoBEC1需識別底物mRNA的特異序列才能編輯，山中伸彌偏據此設計引物擴增，找到了ApoBEC1的一個新底物——抑制蛋白質翻譯的基因Nat1的表達產物。ApoBEC1過表達後，Nat1蛋白質消失[5]。從邏輯上講，如果Nat1是導致ApoBEC1致癌的重要分子，那麼Nat1敲除的小鼠也會長癌。

基因敲除比起轉基因要更加複雜，需要把構建的質粒原位整合到體外培養的胚胎幹細胞中。基因敲除技術不就是山中伸彌博士階段做夢都想學的技術嗎？於是山中伸彌找到所里做基因敲除的專家，當時還是助理教授的Robert Farese，從他的助手Heather Myers那裡學了這項技術的每個細節，並成功地獲得了Nat1敲除的雜合鼠。Heather Myers是山中伸彌的終生好友；山中伸彌發現iPS以後，也公開表達了對Heather Myers的感激，因為是她告訴山中伸彌：胚胎幹細胞不僅僅是做敲除小鼠的手段，其本身也可以是非常有趣的研究對象。

在山中伸彌興緻勃勃地繼續追問Nat1的功能時，他的妻子帶著女兒離開他回到了日本。半年後他覺得一個人的生活實在太悲苦了，決定中斷研究跟隨家人回國。Thomas對自己的博士後也足夠支持，允許山中伸彌帶走3隻珍貴的Nat1敲除雜合鼠。

憑藉他在博士後期間發表的4篇高質量的一作論文，1996年山中伸彌在母校大阪市立大學找到了助理教授的職位，繼續他的Nat1研究。

再一次與預測出現偏差：Nat1敲除後，純合子小鼠在胚胎髮育早期就死了，根本無法觀察到成鼠是否得腫瘤。山中伸彌進一步研究發現，敲除Nat1的胚胎幹細胞在體外不能像正常幹細胞一樣分化[6]。此時他想起了Heather Myers的話：胚胎幹細胞不僅是工具，它本身也可以是非常有趣的研究對象。他的關注點開始轉移到胚胎幹細胞上來。

在剛回大阪的頭幾年，山中伸彌由於剛起步，只能得到少量的基金資助，他不得不自己一個人養幾百隻小鼠，日子過得非常艱苦。同時大阪市立大學醫學院的基礎研究很薄弱，周圍的人不理解山中伸彌研究Nat1在胚胎幹細胞中的功能有什麼意義，總是勸說他做一些更靠近醫藥臨床方面的研究。而Nat1的研究論文提交給雜誌後一直被拒稿。種種壓力與不得志，山中伸彌因之得了一種病——離開美國後的抑鬱症（post America depression,PAD） （自創的玩笑話），幾乎要放棄科研重操舊業做骨科醫生。

在他最低谷的時候，有兩件事把他從PAD中挽救了回來。其一是James Thomson （俞君英的導師，2007年幾乎與山中伸彌同時宣布發現了人的iPS）在1998年宣布從人的囊胚中採集並建立了胚胎幹細胞系，這些幹細胞在體外培養幾個月後還可以分化成不同胚層的細胞，比如腸上皮細胞、軟骨細胞、神經上皮細胞等[7]。這給了山中伸彌巨大的鼓舞，他開始更加堅信胚胎幹細胞研究是有意義的，將來必然有一天會用於臨床。第二件事是條件更加優越的奈良先端科學技術研究生院看上了他的特長，招聘他去建立一個做基因敲除小鼠的中心，並給他提供了副教授的職位。

4 奈良的成蛹階段-Fbx15

千辛萬苦脫了幾層皮後，山中伸彌終於擁有了自己獨立的實驗室，並第一次可以招聘助手。但是問題又來了：研究生的生源是有限的，學生會傾向於選擇資歷更老、條件更好的實驗室，而不一定會選擇剛起步的實驗室。為了「忽悠」學生到他實驗室，山中伸彌冥思苦想了好一陣，提出了一個雄心勃勃的計劃，聲稱實驗室的遠景目標是研究怎麼從終末分化的成體細胞變回多能幹細胞。

當時科學界的主流是研究怎麼把胚胎多能幹細胞分化成各種不同組織的細胞，以期用這些分化的功能細胞取代受損的或者有疾病的組織細胞。山中伸彌認為自己的實驗室沒有實力跟這些成熟的實驗室競爭，那不如反其道而行之，研究怎麼從分化的細胞逆轉為多能幹細胞。

當時科學界的主流觀點認為，哺乳動物胚胎髮育過程中的細胞分化是單向的，就像是時間不可逆轉。這個觀點也並非沒有破綻，比如植物組織就具有多能性：一些植物的莖插入土壤會重新長出一棵植株，也即已經分化的莖細胞可以改變命運分化出新的根莖葉細胞。而早在1962年，也即山中伸彌出生的那一年，英國的John Gurdon爵士報道了他的驚人發現：把蝌蚪的腸細胞核移植到去核的蛙卵中，新細胞可以發育至蝌蚪階段[8]。如果把雜合細胞發育到囊胚期，用囊胚期的細胞核再做一次或多次核移植，那麼就可以發育出可生育傳代的成蛙[8]。進一步地，為了說服人們接受終末分化的細胞核也具有多能性，他把成蛙不同組織的細胞進行體外培養，發現核移植後來源於不同組織的雜合細胞都可以發育到蝌蚪階段[9,10]。1997年，Ian Wilmut和Keith Campbell基於同樣的原理，把羊的乳腺細胞核移植到去核的羊卵中，成功地培育出了克隆羊多莉，引起世界轟動[11]。2001年，日本科學家發現，通過與幹細胞融合，胸腺細胞核獲得了很大程度的重編程[12]。

山中伸彌計劃的第一步是找到儘可能多的，類似於Nat1參與維持幹細胞功能的因子（維持因子的意思是這些因子是胚胎幹細胞在體外培養維持多能性所必需的）。他大膽推測，在分化的細胞中持續表達這些維持因子也許可以讓它變回到多能幹細胞。一旦成功，誘導的多能幹細胞會有著胚胎幹細胞所不具備的優勢：它不僅可以繞開胚胎幹細胞引起的倫理問題，而且病人本身的誘導幹細胞被改造後重新植入病人體內時，由於是自身的細胞，將不會有細胞移植常見的免疫排斥的問題。

在這個遠大前景的感召下，山中伸彌果然「忽悠」了3個學生加入他實驗室。很快地，他們鑒定出一系列的在胚胎幹細胞中特異表達的基因，其中一個基因就是Fbx15。山中伸彌的學生YoshimiTokuzawa發現Fbx15除了特異表達於胚胎幹細胞中外，還能被另外兩個胚胎幹細胞維持因子Oct3/4和Sox2直接調控。山中伸彌跟Yoshimi說：「Fbx15應該參與維持幹細胞多能性和胚胎的發育，我猜你沒有辦法得到Fbx15敲除的純合鼠。」Yoshimi構建質粒做了基因敲除小鼠，把染色體上的Fbx15基因通過同源重組替換成抗G418藥物的基因neo。

複雜的生命又一次愚弄了山中伸彌：Fbx15敲除的純合鼠活得很健康，沒有顯見的表型。山中伸彌又挑戰他的學生說：「好吧，Fbx15也許不是小鼠胚胎髮育所必需的，但是它應該是維持體外胚胎幹細胞所必需的，我打賭你沒有辦法在胚胎幹細胞中徹底敲除這個基因。」勤快的Yoshimi於是用較高濃度的G418從幹細胞中篩到了純合的敲除株，還是活得好好的，沒有表型[13]。山中伸彌後來在回憶的時候打趣道：小鼠很happy，細胞也很happy，唯一不happy的就是可憐的Yoshimi了[4]。

但是花這麼多精力做的敲除小鼠不能就這麼了結了。山中伸彌又一次冥思苦想，找到了廢物利用的辦法：由於Fbx15隻在胚胎幹細胞中表達，Fbx15 啟動子操控的抗藥基因neo在成體的成纖維細胞里不表達，所以細胞在藥物G418處理下會死亡；而敲除鼠里得到的胚胎幹細胞卻可以在很高濃度的G418中生長。如果成纖維細胞能通過某種因子誘導成多能幹細胞，那麼它就會產生對G418的抗藥性。即便成纖維細胞只是獲得了部分胚胎幹細胞的特性，那麼它也應該能抗低濃度的G418（圖1）。

Fbx15敲除鼠實際上提供了很好的篩選誘導幹細胞的系統！

【圖1篩選iPS的系統，在Fbx15敲除鼠的基因組內，Fbx15基因被neo基因取代。在成鼠角形的成纖維細胞中，內源的Fbx15 啟動子關閉，neo不能表達，細胞在G418藥物處理下會死亡；在圓形的多能幹細胞中，Fbx15 啟動子會啟動neo，細胞能在G418中生長。成纖維細胞在體外培養後感染攜帶幹細胞維持因子的逆轉錄病毒，如果能夠被重編程成多能幹細胞（iPS），就能逃過G418的選擇壓力，增殖形成細胞克隆（該圖修改自[14] ）。】

憑藉他鑒定胚胎幹細胞維持因子的出色工作，2004年山中伸彌在名氣更大的京都大學找到了新的職位。除了Fbx15敲除鼠的篩選系統，山中伸彌還積累了他鑒定的加上文獻報道的24個候選維持因子。山中伸彌躍躍欲試，準備破殼而出，拍翅成蝶了！山中伸彌的另一位學生Kazutoshi Takahashi此前

已經發表了一篇關於幹細胞致癌性的Nature文章。山中伸彌決意讓他來承擔最大膽的課題——逆分化成體細胞，因為他知道，有一篇Nature文章保底，即使接下來的幾年一無所獲，他的學生也扛得住。

即便有很好的篩選系統，這個課題在當初看來也是非常冒險甚至是不可行的。首先，當時人們普遍認為成體細胞失去了多能性，也許成體細胞本身就是不可逆轉的，你做什麼也沒有用。其次，即便通過轉核技術實現了成體細胞核命運的逆轉，那也只是細胞核，不是整個細胞。胚胎細胞和成體細胞的染色體是一樣的，細胞核具有全能性，尚可理解。而且要實現細胞核的逆轉還需要把核轉到卵細胞中，讓卵細胞質幫助它重編程，而卵細胞質中的蛋白質不計其數。如果要實現整個細胞命運的逆轉需要讓細胞質中所有的蛋白質重新洗牌，難度可想而知。最後，即便細胞可以重新編程，那也應該是很多蛋白質共同參與的。山中伸彌當年在手上的僅僅是24個因子。也許有另外幾百幾千種因子被遺漏，缺少其中任何一種都無法實現重編程。用這24個因子異想天開要實現細胞命運的逆轉，根據已有的知識從邏輯上講可能性幾乎為零。

Kazutoshi初生牛犢不怕虎，他給成纖維細胞一一感染過表達這些因子的病毒，結果當然沒有篩選到任何抗G418的細胞。山中伸彌知道如何保持學生的鬥志，他故作鎮定地說：「你看，這說明我們的篩選系統很好啊，沒有出現任何假陽性。」

在試了一遍無果後，Kazutoshi大膽提出想把24個病毒混合起來同時感染細胞。山中伸彌覺得這是很愚蠢的想法：「沒人這麼干過啊同學，不過死馬當作活馬醫，你不嫌累的話就去試吧。」

等了幾天，奇蹟竟然發生了。培養板上稀稀疏疏地出現了十幾個抗G418的細胞克隆！一個劃時代的發現誕生了。

關鍵實驗取得突破以後，其後的事情就按部就班了。Kazutoshi每次去掉一個病毒，把剩下的23個病毒混合感染成體細胞，看能長多少克隆，以此來鑒別哪一些因子是誘導幹細胞所必需的。最後他鑒定出了4個明星因子：Oct3/4，Sox2，c-Myc和Klf4。這4個因子在成纖維細胞中過表達，就足以把後者逆轉為多能幹細胞！

那麼抗G418的細胞克隆就一定是多能幹細胞嗎？他們通過一系列的指標，比如基因表達譜、分化潛能等，發現這些細胞在相當大的程度上與胚胎幹細胞相似。2006年山中伸彌報道了小鼠誘導幹細胞，引起科學界轟動[14]；2007年，他在人的細胞中同樣實現了細胞命運的逆轉，科學界沸騰了[15]！

回過頭來看，種種不可能，山中伸彌怎麼就中彩票了呢？現在通過更多的研究人們發現，幹細胞特性的維持是由一個基因網路來共同作用的，通過上調某些關鍵基因就可以重建這個網路，逆轉細胞的命運；山中伸彌最後鑒定的這4個因子也不是必需的，用這4個因子以外的其它因子進行組合可以達到同樣的目的。這好比是一張大網，你只要能撐起其中的幾個支點，就可以把整張網撐起來。當然，山中伸彌的成功也有相當大的僥倖成分，假設在他的24個候選因子中缺了這4個明星分子中的一個，那麼他無論怎麼努力也沒有辦法得到iPS。

iPS的發現有著不同尋常的意義。首先，它更新了人們的觀念，從此之後人們不再認為細胞的命運不可逆轉，不但可以逆轉，細胞其實還可以實現不同組織間的轉分化（transdifferentiation）。其次，iPS細胞繞過了胚胎幹細胞的倫理困境，很多實驗室都可以重複這個簡單的實驗得到iPS，開展多能幹細胞的研究。其三，iPS細胞具有很多胚胎幹細胞所沒有的優勢：將來自於病人自身的iPS細胞體外操作後重新植入病人體內，免疫反應將大大減少；如果將病人的體細胞逆轉為iPS細胞，在體外進行分化觀察在這個過程中出現的問題，就可以實現在培養皿里某種程度上模擬疾病的發生；疾病特異的iPS在體外擴增和分化以後，還可以用於篩選治療該疾病的藥物，或者對藥物的毒性進行檢測（圖2）。

【圖2iPS細胞的潛在用途，采自病人的少量成體細胞被重編程成iPS細胞後，能夠在體外增殖、改造、分化成組織特異性的功能細胞。這些功能細胞重新植入人體有望幫助/取代受損的或者得病的器官/組織。iPS或者這些功能細胞也可作為疾病模型用於一些藥物的篩選和毒性測試。】

但是這僅僅是新的開始，生命科學如此複雜和不可預測，要把這些願景變成現實，讓iPS真正造福人類，這其中還要克服九九八十一難。山中伸彌 Yamanka，這位科學的寵兒和頑主，懷著最初幫助更多病人的理想，無畏地踏上了新的征程。

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[4] Yamanaka S. Induction of pluripotency by defined factors [DB/OL]. Bethesda, Md. : National Institutes of Health, （2010-1-14）. https://videocast.nih.gov/Summary.asp?File=15547

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[15] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007, 131: 861-872