結直腸癌：MSI，dMMR，林奇綜合征

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微衛星不穩定（Microsatellite Instability） 是什麼？

1，首先明確微衛星的概念：人類基因組上的一段串聯重複序列（1~6個重複單元），這些微衛星通常位於基因間隔區、啟動子、UTR和編碼區。舉例說明：AGGT(A)26GGGT，該微衛星位於2號染色體，MSH2基因，5號內含子，名稱為BAT26。人類基因組上有許多這樣的串聯重複序列，即微衛星，至少有50萬個。

2，Monmorphic microsatellite 與 Polymorphic microsatellite：我們知道人體的細胞內的基因組一半來源於母親，另一半來源於父親。那麼對於某個特定的微衛星，如BAT26，它的A在母親基因組上是重複26次，在父親基因組上也是重複26次嗎？並不一定是這樣的。如果在人群中統計，該微衛星單元重複次數（> 99%的人群）幾乎都是一樣的，則Monmorphic microsatellite。如果在人群中統計，該微衛星單元重複次數（> 1%的人群）有不一樣的，則Polymorphic microsatellite。

3，微衛星不穩定（MSI）：某些細胞的某個位置的微衛星串聯重複次數發生改變。MSI要達到檢測水平，需要該細胞進行擴大信號（單克隆或者寡克隆），所以一般MSI常見於腫瘤中。

4，所有CRC患者中，表現MSI的約為15%（林奇綜合征3~5%，散發12%~15%），表現No MSI的約為85%（FAP0.5%，散發85%）。

MSI發生的原因是什麼？

基因組在複製時候會發生一些錯誤，人體類有錯配修復系統來識別並修正這些錯誤。但是如果錯配修復系統出問題，那麼這些錯誤可能就無法被正確修復。微衛星複製的時候的錯誤可能會被保留，如原來的50各重複單元可能會變成60個。

MSI發生有兩個原因：1）錯配修復基因MLH1, MSH2, MSH6或者PMS2發生胚系突變；2）MLH1基因啟動子區域的超甲基化，散發的結直腸癌表現出dMMR幾乎屬於這種情況。值得一提的是，某些腫瘤即使沒有dMMR也表現出低頻的MSI，這種情況可以看作是背景噪音。

補充：錯配修復基因的缺陷並不會影響所有的微衛星，只是基因組上的一部分。

為什麼要檢測MSI？

1，預後：MSI較MSS的CRC患者有更好的預後，不傾向於淋巴結轉移與遠處轉移。HR(OS): 0.65; HR(PFS): 0.67。

2，治療：MSI較MSS的CRC患者對化療方案響應可能不一樣，其中II期MSI的CRC患者可能不受益於5-FU方案但仍然有更好的預後。

3，診斷：MSI檢測有助於篩查林奇綜合征。

檢測MSI的方法是什麼？

基因組中存在至少50萬個微衛星，選取哪些微衛星的狀態作為標準是個問題。早期的研究者憑藉自己的經驗來選取Markers，這不免會引入主觀因素。最終形成Bethesda Panel：3個二核苷酸Marker (D2S123, D5S346, D17S250)，2個單核苷酸Marker (BAT26, BAT25)。進一步：MSI-H為40%及以上的Marker表現出不穩定，MSI-L為< 40%且至少有一個Maker表現出不穩定，MSS為無Marker表現出不穩定。

1，PCR法。設計目標微衛星的引物，腫瘤組織與正常組織同時PCR，觀察腫瘤組織是否會多出現一個（峰值）克隆片段。如果是，則該Marker提示該微衛星不穩定。針對Bethesda Panel的五個Marker分別設計引物，然後PCR，再根據上述的判定規則可得出結論。

2，免疫組化。由於MSI主要是dMMR引起，因此可以間接的檢測MMR相關蛋白以推斷MSI狀態。通過免疫組化檢測MLH1, MSH2, MSH6, PMS2的表達情況，推斷MSI情況。以下是染色表達缺失與對應的缺陷基因：（MSH2 and MSH6）[MSH2 or MSH6]；(MSH6) [MSH6]；(MLH1 and PMS2) [MLH1 or PMS2], (PMS2) [PMS2]。

3，測序法。理論上是可行的，但是並未獲得廣泛共識與使用。目前南京世和運用NGS技術推出了檢測22個微衛星以判定MSI狀態。

權威指南對MSI檢測時機的推薦？

NCCN指南指出：

1，對於所有小於70歲的結直腸癌患者和大於70歲但符合Bethesda Guidelines的結直腸癌患者行林奇綜合征篩查（IHC for MMR OR PCR for MSI）。

2，免疫組化發現MLH1表達缺失但BRAF V600E存在，可排除林奇綜合征；

（解釋上述原因：1，BRAF突變與MLH1啟動子甲基化有很強的相關性，MLH1啟動子甲基化的患者一般都會發生BRAF突變-87%，MLH1啟動子不發生甲基化患者一般不發生BRAF突變-96%；2，BRAF突變機會都發生在一個位點上V600E-95%；3，BRAF突變一般發生在散發性結直腸癌患者中，不發生在林奇綜合征患者中；4，若MLH1啟動子甲基化，則該MLH1蛋白不或者低表達，免疫組化呈現的結果就是MLH1蛋白表達丟失）；

3，所有II期結直腸癌患者應該行MMR或者MSI檢測。

4，所有轉移性結直腸癌患者都應該行MMR或者MSI檢測。

林奇綜合征（Lynch syndrome, LS，Hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC）（遺傳性非息肉病性結直腸癌）是什麼？

1，由於遺傳性錯配修復基因發生突變而致；

2，常染色體顯性遺傳；

3，隨著時間推移，高風險發生癌症：結直腸癌，子宮內膜癌，卵巢癌，胃癌，小腸癌，肝膽癌，上泌尿道癌，腦癌，皮膚癌。

怎麼樣的情況可診斷為林奇綜合征？

先來點乾貨。林奇綜合征經典篩查路徑（中山大學腫瘤防治中心）：1，該篩查圈定在結直腸癌患者中；2，用Amsterdam 標準II與改良版Bethesda標準評估，若不符合二者標準則判定為散發性結直腸癌；3，若符合上述評估標準，則進行MSI檢測（PCR或者IHC）；4，MSI為陰性，判定為散發性結直腸癌；5，MSI為陽性，則判定為疑似Lynch綜合征，MMR基因測序進一步確認。

再來點乾貨。林奇綜合征分子篩查流程（中山大學腫瘤防治中心）：1，MMR蛋白免疫組化檢測；若為陰性，且不符合改良版Bethesda標準，則為散發性結直腸癌；若為陰性，但符合改良版Bethesda標準，則進行MSI檢測進一步評估；2，MSI陽性與MMR蛋白缺失需要分兩種情況：MSI-H但是MLH1甲基化/BRAF突變判定為散發性，MLH1表達缺失/PMS2表達缺失但是MLH1甲基化/BRAF突變判定為散發性，MSI-H/MMR蛋白缺失不是由於MLH1甲基化（BRAF突變）造成則進入下一步評估；3，MMR基因胚系突變檢測。（終極判斷）。

共識與會議促成了一些標準，這包括阿姆斯特丹標準和貝塞斯達標準，目前用的更多的是修改版的貝塞斯達標準。其中，不同的標準傾向性是不同的。

A 阿姆斯特丹標準I （Amsterdam I Criteria）：該標準認為患者被確診為林奇綜合征，他至少有三個親屬為組織確認性結直腸癌。1，一個親屬為另兩個的一級親屬；2，至少兩個連續世代受影響。3，至少有一個是在50歲之前被確診為結直腸癌；4，家族性腺瘤息肉病（FAP）已經被排除了。

B 阿姆斯特丹標準II （Amsterdam II Criteria）：該標準認為患者被確診為林奇綜合征，他至少有三個親屬為LS相關癌症（結直腸癌，子宮內膜癌，胃癌，卵巢癌，輸尿管癌，腎癌，骨盆癌，小腸癌，肝膽癌，皮膚癌）。1，一個親屬為另兩個的一級親屬；2，至少兩個連續世代受影響。3，至少有一個是在50歲之前被確診為LS相關癌症；4，家族性腺瘤息肉病（FAP）已經被排除了。5，腫瘤應當通過病理確認。

C 改良版Bethesda標準：滿足下列任意情況需對患病個體進行MSI檢測初篩。1，結直腸癌患者年齡小於50歲；2，存在同時性或異時性，結直腸及其他Lynch綜合征相關腫瘤，無論患者年齡；3，60歲以內的結直腸癌患者存在MSI-H組織學特點；4，結直腸癌患者有1個及以上一級親屬患有Lynch綜合征相關腫瘤，其中一個腫瘤發病年齡早於50歲；5，結直腸癌患者有2個及以上一級或二級親屬患有Lynch綜合征相關腫瘤，無論發病年齡。

其實上述給出的幾個標準只是限定了林奇綜合征的範圍，相當於畫了一個圈，在圈內的才能被診斷為林奇綜合征，而圈內具體的診斷標準並未給出。

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