探尋多發性硬化患者的腦脊液生物標記物

腦脊液（CSF）靠近中樞神經系統的腦實質，可以反映出 CNS 炎症性疾病，如多發性硬化（MS）的免疫病理。多參數流式細胞儀可確定 MS 患者腦脊液的免疫改變。

近期 Alvermann 教授在 JAMA Neurology 發表文章，通過檢索 MEDLINE 中 1980~2013 年發表的、用流式細胞術對 MS 患者腦脊液白細胞亞群進行用研究的文獻。系統闡明 MS 腦脊液的細胞改變，將 MS 與生理狀態、其它 CNS 疾病相鑒別；將相關發現整合進 CNS 白細胞轉運的模型中；強調治療相關的白細胞亞群的改變；評估腦脊液免疫表型，尋找新型 MS 生物標記物。

所有文獻均顯示，MS 可見腦脊液細胞增多。有趣的是，腦脊液富含輔助性 T 細胞（TH1 和 TH17 亞型）和調節性 T 細胞；鞘內 B 細胞的分化導致漿母細胞和漿細胞產生抗體；其它的白細胞類型，包括自然殺傷細胞、單核細胞和樹突狀細胞亦有改變。

闡明腦脊液的細胞改變增進了我們對 MS 病理的認識，為個體化的預後和治療決策提供了生物標記物的相關信息。然而，多數報道缺乏證明有效性的對照設計。

隨著科技的進步，MS 腦脊液細胞的免疫表型與不同疾病階段（活動期和緩解期）的細胞亞群的關係將變得日益重要。應將評價腦脊液細胞數量和成分納入臨床試驗的研究。

MS 是 CNS 脫髓鞘性病變，被認為是一種自身免疫性疾病；以腦和脊髓的炎症損害為病理特徵。由於活檢的副作用，CNS 組織並不能常規獲取做出診斷；相反，腦脊液易於獲得且能反映出腦實質內的細胞變化。研究腦脊液細胞的免疫表型可以從病理生理學的角度，提高診斷的精確性，改善對患者預後的評估。

外周血（PB）分析可以鑒別 CNS 特異性免疫病理和全身性疾病。多參數流式細胞技術檢測懸浮液中細胞表型的金標準，已被用於多種神經疾病的腦脊液細胞分析中。由於 MS 患者僅有輕度的腦脊液細胞增多，細胞數目較少可能限制了流式細胞術的使用；因此大多數研究都關注於已經明確的細胞亞群，缺少對腦脊液細胞成分的全面分析。

本文中，我們系統回顧了 MS 患者、健康者以及其它 CNS 疾病患者腦脊液和外周血的細胞學改變；此外，文章還強調了複發 - 緩解型（RRMS）、繼發 - 進展型（SPMS）、原發 - 進展型（PPMS）等 MS 臨床亞型的差異以及治療效應；最後，我們評估了腦脊液免疫表型對尋找新型 MS 生物標記物的作用。

一、MS 的白細胞數量

T 細胞

正常生理狀態下和 MS 時，T 淋巴細胞是腦脊液中主要的細胞類型。與健康者相比，MS 患者腦脊液中包含激活的和大量增生的 T 細胞，反映出存在炎症。與非炎症性的神經系統疾病相比，MS 的腦脊液顯示輔助性 T 細胞（helper T cells，TH）為主，伴隨 CD4:CD8 比率的增高。

與外周血相比，腦脊液中富含 TH1，TH17 和 IL-17 分泌型γδ T 細胞（表 1）；這些細胞類型在局部炎症機制中起著重要的作用。

複發 - 緩解型 MS 可見代償性 CD4+ 調節性 T 細胞（regulatory T cells，Treg），但繼發 - 進展型 MS 則缺乏此種細胞。MS 中，CD4+Treg 和 CD8+Treg 細胞的功能均有損害。複發 - 緩解型 MS 可見表達 CD31 的 T 細胞（提示細胞剛才胸腺釋放出來）減少；由於 CD31+ 細胞可抑制 Treg 細胞，降低胸腺輸出功能，這可能是 Treg 細胞功能損害的原因之一。

MS 腦脊液中可見豐富的 HLA-G+Treg 細胞，但非炎症性神經病變中無此現象；與常規 Treg 細胞不同，這些細胞行使正常的調節功能。

在 MS 和非炎症性神經病變中，腦脊液中 T 細胞大多數為抗原刺激過的 T 細胞（antigen-experienced T cells）；外周血中主要為初始 T 細胞（naive T cell）（表 2）。大部分的研究表明，腦脊液中的主要亞群為中樞記憶性 T 細胞（central memory T cells， TCM cells），此類細胞可歸巢至次級淋巴器官中，有監控功能而無即刻的效應作用。

另一些研究表明，腦脊液中還富含效應記憶性 T 細胞（T cells with an effector memory， TEM cells）；與非炎症性神經病變相比，該細胞類型在炎症性中樞神經疾病中增加。外周血中，CD4+ 效應記憶性 T 細胞的比率與 MRI 監測的 MS 疾病活動程度相關。

表 1. MS 的 T 細胞數量

表 2. MS 的記憶性 T 細胞和激活的標記物

注釋：MHC：major histocompatibility complex，主要組織相容性複合體；NIND：noninflammatory neurological diseases，非炎症性神經疾病

B 細胞

儘管生理狀態下，腦脊液中缺少 B 細胞、漿母細胞和漿細胞，但 MS 的腦脊液中可見這些細胞（表 3）。MS 腦脊液中 B 細胞的平均百分比約為 5%，B 細胞與單核細胞的比率越高，則說明疾病在快速進展。MS 患者腦脊液中的 B 細胞多數為切換的記憶 B 細胞（class-switched memory cells），漿母細胞百分數約為 30%；與其它神經炎症性病變相反，MS 漿母細胞的高比率將穩定而持續。

腦脊液中可見具有生髮中心表型（germinal center phenotype）的細胞群，但外周血中缺如；提示這些細胞來自於鞘內異位淋巴濾泡。靠近 CNS 腦實質的近端淋巴組織通過增加在自身抗原中的暴露，促進自體免疫的過程。

表 3. MS 的 B 細胞數量和標記物

注釋：: CIS：clinically isolated syndrome，臨床孤立綜合征；

自然殺傷細胞（Natural Killer Cells）

CNS 自體免疫中自然殺傷細胞的免疫調節作用正日益受到關注。一些研究發現，MS 患者的自然殺傷細胞的數量下降和功能受損（表 4）。賽尼哌治療時，腦脊液中含有豐富、增多的免疫調節性 CD56bright 自然殺傷細胞。

表 4. MS 的 NK 細胞數量和標記物

單核細胞

單核細胞是正常腦脊液的主要細胞成分，MS 時常顯著性降低。與外周血相比，腦脊液中的單核細胞常表達非典型性 MHC 分子 HLA-G。HLA-G+ 單核細胞為耐受型，可能參與正常生理狀態下 CNS 抑制性免疫微環境。

表 5. MS 的單核細胞數量和標記物

樹突狀細胞（Dendritic Cells，DC）

2001 年 Pashenkov 等人首次報道了腦脊液中存在樹突狀細胞。MS 患者腦脊液中樹突狀細胞的數量在疾病早期最高，但隨著病程的延長而減少（表 6）。與外周血相比，腦脊液中的髓樣樹突狀細胞（Myeloid DCs）的表達高水平的 HLA-DR 和共激分子，提示可強烈刺激 T 細胞。

MS 患者的漿細胞樣樹突狀細胞，在外周血和腦脊液中具有相同的表型，但都偏向前炎症 CD123low 亞群，該亞群可引起 TH17 細胞的反應。

表 6. MS 的 DC 數量和生物標記物

二、白細胞遷移的標記物

白細胞向 CNS 的遷移是 MS 研究的重點，一些研究關注於趨化因子和粘附分子（表 7）。白細胞向 CNS 遷移的可能機制如圖所示。

表 7. MS 白細胞遷移的標記物

圖. 白細胞向 CNS 遷移的途徑和相關白細胞 - 內皮細胞相互的作用：從實質血管中穿越血腦屏障進入 CNS 腦實質（A）；從軟腦膜血管進入蛛網膜下腔（B）；通過脈絡叢進入腦室腦脊液中；趨化因子 - 趨化因子受體的相互作用有助於腦脊液中白細胞隔離（D）。

CXCR3 是 MS 中被研究的最多的趨化因子；與外周血相反，它主要表達在腦脊液的大部分 T 細胞上，提示其主要作用為白細胞隔離。大部分的腦脊液 T 細胞還表達 CCR7，這是中心記憶性 T 細胞的標記物，參與淋巴器官的歸巢機制。事實上，腦脊液的作用可視為 CNS 中的淋巴。

Sato 等人的最新研究顯示，MS 急性複發期的患者，腦脊液中含有豐富的同時表達 CCR2 和 CCR5 的自身反應性 T 細胞，但在其它炎症性 CNS 病變中缺如。值得注意的是，腦脊液中僅含豐富的 CCR2+CCR5+CCR6? TH1 細胞亞群，CCR6+TH17 細胞缺如。

然而，其它研究顯示，臨床孤立綜合征患者的腦脊液中富含 CCR6+T 細胞，這可能提示為 CNS 自體免疫的未成熟狀態。CCR6 參與疾病的啟動機制，促使 T 細胞通過脈絡叢進入腦脊液。

關於白細胞亞群其它趨化因子受體的研究數據較少。但是，趨化因子 CXCL13，在 MS 患者腦脊液中增多，被認為通過其 CXCR5 受體從而參與 B 細胞的募集機制。

與外周血相比，腦脊液中多數粘附分子的表達增多，它們的表達模式在 MS 患者、無菌性腦膜炎和健康對照者中類似，提示著募集具有普遍性的機制。實際上，VLA-4 在腦脊液中所有的 TH 細胞上均有表達，對於 T 細胞向 CNS 的遷移十分重要。

三、治療效應對白細胞亞群的影響

隨著單克隆抗體的發展，一些研究關注於 MS 治療的免疫效應（表 8）。抗 VLA-4 抗體那他珠治療可引起腦脊液中 T 細胞和 B 細胞的持續性減少；而未經治療的患者，外周血中含有豐富的、表達激活的促炎表型的 T 細胞，可通過細胞隔離作用進入 CNS。

芬戈莫德治療可引起循環中 CD4+ 和 CD8+T 細胞、B 細胞的減少，而腦脊液中僅 CD4+ T 細胞減少。儘管那他珠單抗和芬戈莫德均可影響腦脊液的 T 細胞，但只有那他珠單抗治療與進行性多灶性腦白質病變（progressive multifocal leukoencephalopathy，PML）的高風險相關。

PML 是 CNS 的一種機會性的病毒感染；免疫細胞成分和表型的何種改變易引起 PML，是目前研究的一個重點領域。腦脊液中僅有 CD4+T 細胞減少殆盡，可能並不足以增加 PML 的風險。

利妥昔，為抗 CD-20 抗體，可致腦脊液 B 細胞劇烈減少，但鞘內 IgG 合成僅輕度改變。抗體的生成受到 CD20- 細胞的限制，但該細胞並非利妥昔的靶點。因此，穩定的 IgG 水平提示鞘內 IgG 主要由長壽命漿細胞所產生，而非短壽命的漿母細胞（必須由 CD20+ 細胞再生）產生。

但另一項研究認為，IgG 的合成與腦脊液中漿母細胞的數量而非漿細胞的數量更為相關。需要注意的是，利妥昔單抗亦可減少腦脊液中的 T 細胞，這可能為 B 細胞劇烈減少的繼發作用；B 細胞可通過產生細胞因子和抗原呈遞作用影響 T 細胞。

表 8. MS 治療對白細胞亞群的作用

四、討論

採用流式細胞技術分析腦脊液已成為臨床常規檢查，有助於研究 MS 的病理生理學機制；目前普遍認為白細胞的遷移，尤其是記憶性 T 細胞向 CNS 的遷移，是 MS 重要的早期改變。

白細胞從血液向 CNS 的遷移經由三條途經：從脈絡叢進入腦室腦脊液中，從腦膜血管進入蛛網膜下腔，以及從實質血管進入 CNS 腦實質中（圖）；其中第三條途經在生理狀態下很少存在，但炎症、血腦屏障被破壞時可導致白細胞向 CNS 滲入增多。雖然腦脊液和腦實質直接的細胞交換機制尚不完全清楚，但腦脊液和外周血中 T 細胞和 B 細胞的關係支持該假設。

在 CNS 內，自體反應性 T 細胞可被抗原呈遞細胞反應性激活。MS 早期，樹突狀細胞在腦脊液內聚集，隨著病程的延長而數量逐漸減少，提示其在疾病的始動中具有重要作用。隨後，樹突狀細胞的作用減弱，記憶性 T 細胞的大量增生維持著慢性免疫反應。調節性 T 細胞的功能缺損可能損害了機體對髓鞘抗原的耐受。

此外，CNS 內 B 細胞的募集可產生抗體生成細胞，促使疾病向非抗體依賴性的過程進展（如抗原呈遞和細胞因子的分泌）。異位淋巴組織可能為自體反應性 B 細胞的慢性增殖提供了微環境，同時異位淋巴組織也是其它自體免疫疾病的靶器官。

儘管我們已對 MS 腦脊液細胞的免疫表型有了一些了解，但在其病理生理的作用還存在理解的局限。白細胞向 CNS 遷移的不同途徑可能與 CNS 自體免疫並不相關；因此腦脊液的細胞成分與炎症組織內的細胞成分並不相同。譬如，腦脊液中以 CD4+T 細胞為主，但腦實質內淋巴細胞的浸潤以 CD8+T 細胞為主。腰椎穿刺取得的腦脊液標本與腦室內腦脊液可能也不相同。

此外，確定 MS 的特異性病變（其它神經炎性疾病中不存在）仍是一項艱巨的挑戰。MS 腦脊液中可見的豐富的細胞亞群（如 IL-17 分泌型γδ T 細胞和 CCR2+CCR5+T 細胞），在其它炎性 CNS 疾病中缺如；但對於這些研究數據的解釋必須小心謹慎，因為其它炎性 CNS 疾病的病理各異。

如有縱向研究數據，則可促進腦脊液分析的特異性。腦脊液中漿母細胞的持續性增多是 MS 的典型性發現，該現象在神經炎症性病變中罕見。但由於難以重複進行腰椎穿刺，因此腦脊液的研究缺乏這樣的縱向數據。單次的腦脊液標本只能反映出免疫反應大量動態變化的一個瞬間。

腦脊液分析在未來的作用如何？儘管有著上述的局限性，但腦脊液細胞免疫表型的分析還是具有診斷價值的，可以評估不同疾病的異質性，作出個體化的預後評價，優化治療決策。

在目前為止，尚無 MS 的細胞標記物可滿足臨床實踐的需要。完全理解腦脊液的生物標記物，需要進行大規模的前瞻性、多中心的對照研究，各研究中心之間需要採用標準化的標本採集方法和程序。對照組的定義也很重要，因為很難採集到嚴格意義上的健康參與者的腦脊液。MRI 檢查也有助於確定腦脊液標記物的價值。

為滿足這些研究質量的標準，我們建議腦脊液細胞分析應該採用臨床試驗完成；這樣才最能確定可預測病程、治療效果和副作用（如 PML）風險的、可靠的生物標記物。

從這樣的臨床試驗中獲得的信息，有助於我們預測不同治療方案的成功率和風險，為治療的決策提供基石。現在 FDA 批准的 MS 的治療藥物日益增多，因此需要建立一個選擇最佳藥物、為患者進行個體化治療的新決策模型。

在未來，臨床試驗和 MRI 影像研究可為 MS 患者尋找出個體化的免疫標記物；如果我們能找到有效的腦脊液標記物，則可大大改進 MS 這一異質性疾病的治療效果。

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編輯： neuro202