影響反轉錄效率的因素有哪些？

1970年Baltimore, D. 和Temin, H. M.等學者發現了反轉錄酶，證明遺傳信息不僅由DNA到RNA，也可由RNA到DNA ，這一發現對分子生物學的中心法則進行了修正和補充。

反轉錄就是反轉錄酶以RNA為模板，根據鹼基互補配對原則，合成cDNA的過程。

今天為大家分享有關反轉錄的一些理論知識，主要包括反轉錄酶的概述和反轉錄的實驗策略這兩大方面。

01反轉錄酶的概述

1反轉錄酶的酶學特性

• 具有依賴於DNA或 RNA模板的DNA聚合酶活性， 反轉錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。
• 具有降解DNA:RNA雜合雙鏈中RNA的RNase H活性；
• DNA聚合酶活性和RNase H活性均為病毒複製循環所必需。這兩個活性中心在結構上是相互獨立、單獨摺疊的兩個結構域，在反轉錄酶上的相對位置固定。其中，DNA 聚合酶結構域位於N端，RNase H結構域位於C端；

2反轉錄酶的結構研究

Kohlstaedt L A等研究者於1992年在Science上發表一篇報道，提出了HIV-1 RTase的右手結構模型，其中「手指」是與合成中引入的脫氧核苷酸相互作用，「拇指」是與模板相互作用，「手掌」是催化磷酸轉移。

3DNA聚合酶活性

• DNA聚合酶活性的持續合成能力是指RT酶與引物/模板結合，延伸，解離這樣一個循環所能摻入的核苷酸的平均數目；RTase的持續合成能力比較低 ，通常條件下小於1 kb；所以要繼續鏈的延伸，必需有RTase分子重新結合到引物/模板複合物上 。
• DNA聚合酶活性的保真性是比較低的，RT酶錯配率是10-6～10-4，而宿主DNA聚合酶錯配率是10-11～10-7，這主要是由於RT酶缺乏5』-3』和3』-5』外切酶活性。

4RNaseH活性

RNase H活性為病毒生命周期中複製循環所必需；可以降解DNA:RNA雜交鏈上的RNA； RNase H活性限制了RT酶的合 成長度；我們可以通過RNase H Minus提升cDNA合成長度。

5幾種代表性RT酶

常見代表性RT酶有HIV1 RTase、AMV RTase和MMLV RTase。其中，HIV1 RTase是研究最早、最透徹的RT酶；AMV RTase是源自禽成髓細胞瘤病毒 （禽源），該酶的RNase H活性強，合成長度短，合成量低，熱穩定性好（42～55℃）；MMLV RTase是源自莫洛尼鼠白血病病毒 （鼠源），該酶的RNase H活性弱，合成長度長，合成量高，熱穩定性差（37～42℃）。

02反轉錄實驗策略

1常規反轉錄方法與優化的反轉錄方法

• 常規的反轉錄體系需要把模板、引物、dNTP、反應緩衝液、RNA 酶抑製劑和反轉錄酶等組分逐一加入同一PCR管，然後進行反轉錄。
• 優化的反轉錄體系（以我們公司AT321產品為例）就是在反應時，只需加入模板RNA和水即可高效合成第一鏈cDNA。操作簡便，降低操作過程中的污染機率。
• 常規的反轉錄程序需要1.5h，而優化後的反轉錄程序只需要0.5h（for PCR），或者15min（for QPCR），這樣大大節約的時間。

2反轉錄效率的影響因素

• RNA模板的品質不好會對反轉錄效率造成一定的影響。
• 常用的反轉錄引物有Random primer、Oligo(dT) primer和Sequence-specific primer。

Random primer可以隨機與模板結合，然後進行反轉錄；Oligo(dT) primer與真核生物的mRNA的Poly（A）進行有效地結合，然後進行反轉錄；Sequence-specific primer是針對特定基因設置的引物，多用於一步法熒光定量PCR實驗。

當反轉錄體系中加入引物是Oligo(dT) primer時，如果mRNA模板有些高級結構，那麼cDNA合成過程中就會受阻，mRNA上遠離3』端的基因和高級結構處的基因序列就無法獲得。若在前面的反轉錄體系中再加入Random primer，那麼就可以獲得mRNA上遠離3』端的基因，但是高級結構處的序列仍無法獲得，這個在後面的內容會詳細介紹。

• 反轉錄酶對反轉錄效率影響主要包括RNase H活性、聚合酶活性的合成能力、RT酶保真性和熱穩定性RT酶等等。

RNase H活性在前面內容已有介紹，這裡不再贅述；

聚合酶活性的合成能力主要取決於RT酶的動力學範圍，它是指對不同濃度RNA模板的RT效率一致時，RNA模板的濃度範圍。因此，我們要選擇高品質RT酶，這種RT酶的動力學範圍寬廣，對低濃度RNA可以有效反轉，並且對高濃度RNA沒有抑制。

RT酶保真性低原因是缺乏3 』-5』外切酶活性，那麼我們可以在RT酶中加入具有3』-5』外切酶活性的蛋白，賦予其校正功能，實現高保真RT-PCR。

RT酶熱穩定性提高，可以打開複雜模板中二級結構，cDNA合成繼續，但是要求RT酶熱穩定性高，這個問題可以通過點突變提高RT酶的熱穩定性來解決。

3去除基因組的同時反轉錄

傳統去除gDNA的方法是使用DNase Ⅰ處理，隨後再對該酶進行失火，操作繁瑣；我們公司目前研發出一款新的酶-gDNA Remover，可以有效地切割雙鏈DNA，但對單連DNA沒有作用；所以cDNA合成步驟和DNA去除步驟同時進行，RTase失活和 gDNA Remover失活同時進行。

4microRNA（miRNA）的概述及檢測

• microRNA在動植物體內廣泛存在，可以抑制特定基因表達，在表達調控中有重要作用；microRNA序列高度保守，長度18 ～ 25 nt。
• microRNA檢測方法有Northern Blot、Micro array、Real-time RT-PCR（qRT-PCR）等。

其中，Real-time RT-PCR（qRT-PCR）實驗方法可進行高通量檢測，也可檢測微量miRNA；可區分前體miRNA與成熟miRNA；可區分單鹼基差異；並且易於操作。

qRT-PCR檢測microRNA時，可通過miRNA特異引物和miRNA加尾法合成較長的cDNA序列，方便後續基因的檢測。

祝大家科研順利！