代謝組學樣本收集指南（一）| 代謝組專題

07-17

來自專欄生物科研

代謝組學研究的樣本主要是尿液、血漿或血清、唾液，以及細胞和組織的提取液等。由於代謝譜容易受到眾多因素的影響，收集代謝組學研究的樣本需要根據實驗設計、樣本特徵進行嚴格的控制，考慮收集的時間、樣本的保存條件和保存時間等的平行性。特別是臨床生物樣本不易控制，要考慮受試患者和健康對照人群之間的年齡、性別、飲食狀況、作息習慣、體重、用藥情況等因素的匹配。這些因素的改變均可導致代謝譜的變化，影響實驗結果。

特別注意：

樣本採集需要馬上進行萃滅：快速使組織或細胞內的酶失活，防止代謝物的變化。液氮速凍是常用的萃滅方式。

一. 血清、血漿樣本收集

1.血清與血漿相比，血清不含纖維蛋白原。

2.血清中代謝物的含量略高於血漿，血清和血漿均可用於代謝組學研究，但是取樣盡量一致，要麼都用血清，要麼都用血漿。

1血清

1.1 樣本量要求

NMR實驗500 μL/樣本；GC-MS，LC-MS實驗200 μL/樣本，避免反覆凍融。

1.2 樣本收集步驟

1）血液收集在離心管中37°C(或室溫)靜置30 min或1 h進行凝固分層；

2）3000 rpm室溫離心10 min，待血細胞完全沉降到管底後，取上清轉至乾淨的離心管中；

3）再12000 rpm 4°C離心10 min，取上清分裝到1.5 mL離心管中，每管0.2 mL，-80 °C凍存，乾冰寄送。

1.3 注意事項

1）取血時如用酒精消毒，請擦乾擦拭部位，待酒精完全揮發後再取樣；

2）取血時如用麻醉劑，建議用異氟醚，防止在NMR血清譜圖中出現干擾峰；

3）血清參考產率≈30%~50%，例如1 mL全血大約能得0.3~0.5 mL血清；

4）采全血時如使用真空采血管，請務必使用無預加抗凝劑的凝血管；

5）建議盡量多的收集樣本並分裝凍存，且避免反覆凍融。

2血漿

2.1 樣本量要求

NMR實驗500 μL/樣本；GC-MS，LC-MS實驗200 μL/樣本，避免反覆凍融。

2.2 樣本收集步驟

應使用肝素鈉抗凝管採集全血，並儘快進行血漿分離：3000 rpm室溫離心10 min，待血細胞完全沉降到管底後，取上層，0.2 mL/管分裝至1.5 mL離心管中。-80°C凍存，乾冰寄送。

2.3 注意事項

1）取血時如用酒精消毒，請擦乾擦拭部位，待酒精完全揮發後再取樣。

2）對於抗凝管的選擇：代謝組學實驗檢測推薦使用肝素鈉抗凝管（因為檸檬酸是TCA 循環中的重要物質，使用檸檬酸鈉抗凝劑會引入外源污染；EDTA會影響NMR采譜）。但肝素鈉會對 RNA 相關實驗有負面作用。

3）最後分裝保存推薦使用1.5 mL凍存管，因為螺口凍存管管帽內有一個橡膠墊圈，目的是為了密封。

4）血漿參考產率≈50%，例如1 mL全血大約能得0.5 mL血漿。

二.尿液/唾液/瘤胃液/腦脊液樣本收集

1尿液

1. 樣本量要求

1 mL/例。

2. 樣本收集步驟

收集尿液的前一天飲食要清淡。晨起中段尿（臨床）或晨間 1 h 尿（動物），4℃ 10000 rpm離心10 min，取上清，用1.5 mL離心管分裝保存，每管1 mL，-80 ℃冰箱凍存。最好保存兩管，以保證兩次實驗的量。足量乾冰寄送。

3. 注意事項

動物1 h尿量不夠，可分多次收集，若要收取24 h尿液，請使用帶有低溫裝置的代謝籠收取，及時凍存。

2唾液

1. 樣本量要求

0.5 mL/例。

2. 樣本收集步驟

禁食禁煙禁酒2 h以上，上午9:30-11:30取樣，蒸餾水漱口，將唾液外吐於無菌痰杯內（保持冰浴），不要咳痰，收集5-10 min，4℃ 10000 rpm，離心10 min，取上清，再經0.22 μm濾膜過濾除菌，500 μL分裝，保存於-80℃。

3瘤胃液

1. 樣本量要求

1 mL/例，建議多取一些。

2. 收集步驟

瘤胃液經 6000×g 離心15 min，取上清，1 mL分裝，-80 ℃凍存，乾冰寄送。

4腦脊液

1. 樣本量要求

200 μL/例。

2. 收集步驟

取樣後，4℃ 10000rpm離心10 min，取上清，200 μL分裝保存。保存於-80 ℃，乾冰寄送。

三.細胞樣本收集

適用細胞類型：哺乳動物細胞系

1. 樣本量要求

1×107 cell/樣本，提供2份樣本。

2. 樣本收集步驟

懸浮細胞：

1）連同培養基轉移到15 mL的離心管（進口）中。

2）1000 g離心10 min收集細胞（1×107個細胞為宜），棄上清。

3）用預冷的PBS小心重懸清洗沉澱一次，1000 g離心10 min收集細胞，棄上清。

4）再用PBS重懸並離心一次，倒掉PBS（盡量倒乾淨），將離心管的尖端插入液氮中，萃滅細胞沉澱1 min。-80°C凍存，乾冰寄送。

注意事項：

1) 請先拿空離心管的尖端插入液氮中試試離心管的質量，如果不破則沒問題，如果插入液氮中就破了，那麼就省掉萃滅這一步。

2) 操作盡量迅速，培養基盡量倒乾淨，如有濾紙，可以用濾紙條將底部殘留的培養基吸盡。

貼壁細胞：

1）棄培養液，並將培養皿倒置於吸水紙上吸干培養液。

2）加入4℃預冷的PBS（若用移液槍加，則靠著培養皿壁加入，以免將細胞衝起），平放輕輕搖動1分鐘洗滌細胞，然後棄PBS，重複以上操作兩次以洗去培養液。

3）將培養皿置於冰上，向培養皿內加入4℃預冷的500 μL預冷的甲醇-水（4：1，V/V），用乾淨的細胞刮棒將細胞刮於培養皿的一側（動作要快），冰上斜置培養皿，使得緩衝液流向一側，用移液槍吸取細胞溶液至預冷的離心管內。

4）再向培養皿中加入500 μL甲醇-水（4:1，V/V），將剩餘的細胞盡量全部轉移至離心管中，1000 g離心10 min收集細胞，棄上清；液氮速凍萃滅，保存於-80 ℃，乾冰寄送。

注意事項：需使用色譜純的甲醇以及雙蒸餾水。

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