微生物檢驗必須要知道的三大耐葯機制

1、 β—內醯胺酶(β-lactamase)

　　β—內醯胺類抗生素都共同具有一個核心β—內醯胺環，其基本作用機制是與細菌的青黴素結合蛋白結合，從而抑制細菌細胞壁的合成。產生β—內醯胺酶是細菌對β-內醯胺類抗菌藥物產生耐葯的主要原因。細菌產生的β-內醯胺酶，可藉助其分子中的絲氨酸活性位點，與β—內醯胺環結合併打開β—內醯胺環，導致藥物失活。迄今為止報道的β—內醯胺酶已超過300種，1995年Bush等將其分為四型：第1型為不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶；第2型為能被克拉維酸抑制的β-內醯胺酶；第3型為不被所有β—內醯胺酶抑製劑抑制的金屬β-內醯胺酶(需Zn2+活化)。可被乙二胺四乙酸和P-chloromercuribenzate所抑制；第4型為不被克拉維酸抑制的青黴素酶。臨床常見的β—內醯胺酶有超廣譜β—內醯胺酶、頭孢菌素酶(AmpC酶)和金屬酶。

（1）超廣譜β-內醯胺酶(Extended-Spectrumβ-lactamases,ESBLs)

　　ESBLs是一類能夠水解青黴素類、頭孢菌素類及單環類抗生素的β—內醯胺酶，屬Bush分型中的2型β—內醯胺酶，其活性能被某些β—內醯胺酶抑製劑(棒酸、舒巴坦、他唑巴坦)所抑制。ESBLs主要由普通β-內醯胺酶基因(TEM—1，TEM—2和SHV—1等)突變而來，其耐藥性多由質粒介導。自1983年在德國首次發現ESBLs以來，目前已報道的TEM類ESBIs已有90多種，SHV類ESBLs多於25種。TEM型和SHV型ESBLs主要發現於肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，亦發現於變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和其他腸桿菌科細菌。

　　國內近年來隨著三代頭孢菌素的廣泛使用，產ESBLs菌的檢出率逐年增加。NCCLs規定，凡臨床分離的大腸埃希氏菌和克雷伯氏菌均應監測是否為產ESBLs菌株；若產生，無論體外對第三代頭抱菌素、氨曲南的葯敏結果如何，均應報告對三代頭孢菌素及氨曲南耐葯。另外，ESBLs菌株不僅對β-內醯胺類抗生素有很高的耐葯率，而且對氨基糖苷類、喹喏酮類耐葯率也在60％左右，因此，臨床遇到由ESBLs引起的感染時，建議首選含β—內醯胺酶抑製劑的復方抗生素製劑或亞胺培南；對於頭孢吡肟等四代頭孢，尚有爭議，根據抗菌葯的PK／PD理論，適當改變給藥劑量和給葯間隔。以使血葯濃度超過細菌MIC的時間達40％給葯間隔以上，或許是有效的。

（2）頭孢菌素酶(AmpC酶)屆Bush分類中的1型(Ⅰ型) β—內醯胺酶。

　　通常將其分為由染色體介導產生的AmpC β—內醯胺酶和由質粒介導產生的AmpC β—內醯胺酶，前者的產生菌有陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌等，後者主要由肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌產生。AmpC酶可作用於大多數青黴素，第一、二、三代頭孢菌素和單環類抗生素。而第四代頭孢菌素、碳青黴烯類不受該酶作用。該酶不能被β—內醯胺酶抑製劑所抑制。AmpCβ—內醯胺酶的產生有2種可能：①在誘導劑存在時暫時高水平產生，當誘導劑不存在時，酶產量隨之下降，三代頭孢菌素、棒酸和碳青黴烯類抗生素是誘導型AmpC酶的強誘導劑；②染色體上控制酶表達的基因發生突變，導致AmpC酶持續穩定高水平表達。由高產AmpC酶耐葯菌引起的感染死亡率很高。

　　實際上，所有的革蘭氏陰性菌都能產生染色體介導的AmpC頭孢菌素酶，在多數情況下為低水平表達；在腸桿菌、檸檬酸桿菌、沙雷氏菌、銅綠假單胞菌中可高頻誘導產生，且常為高產突變株。當臨床出現上述細菌感染，開始幾天三代頭孢菌素治療敏感，而隨後發生耐葯時，我們可懷疑為高產AmpC酶的細菌感染，四代頭孢菌素和碳青黴烯類抗生素不受具影響，可供臨床選用。含酶抑製劑的復方製劑不能用於治療產AmpC酶菌株的感染。

（3）金屬酶(metalloβ-1actamase)

　　大部分β-內醯胺酶的活性位點是絲氨酸殘基，但也有一小部分活性位點為金屬離子的酶類。第一個發現的以金屬離子為活性中心的酶是由蠟樣芽抱桿菌產生的頭孢菌素酶，能被EDTA所抑制，之後世界各地均發現了能產生這類酶的各種細菌。1988年Bush首次將該酶定名為金屬β-內醯胺酶(metalloβ-1actamase)，簡稱金屬酶。金屬β-內醯胺酶耐受β—內醯胺酶抑製劑且可水解幾乎所有β—內醯胺類抗生素(包括亞胺培南)。該酶已在氣單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌中發現，其中嗜麥芽窄食單胞菌的亞胺培南耐藥性由染色體介導，而脆弱擬桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌中質粒介導的突變株在日本已有報道。由粘質沙雷氏菌產生的金屬β—內醯胺酶IMP-1型可在類似接合子的intl3上移動，已經傳播到銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和產鹼桿菌。金屬酶可以水解碳青黴烯類和最近開發的第四代頭孢菌素。金屬β-內醯胺酶有廣泛傳播的潛力，對幾乎所有的β—內醯胺類抗生素均具有水解活性，是目前所知的最強的β-內醯胺酶-。

2、氨基糖甙修飾酶(或鈍化酶／滅活酶)

　　在細菌對氨基糖甙類抗生素產生耐葯的機制中，修飾酶介導的耐葯最為流行，酶促修飾的氨基糖甙類抗生素不能與核糖體靶位作用，因此失去抗菌活性。修飾酶主要包括乙醯轉移酶、磷酸轉移酶和核苷轉移酶。三類氨基糖苷修飾酶的作用機制各不相同：乙醯轉移酶(AAC)修飾依賴於乙醯輔酶A的N-乙醯化：磷酸轉移酶(APH)修飾依賴於ATP的O-磷酸化；核苷酸轉移酶(ANT)修飾依賴於ATP的腺苷化。在革蘭氏陰性病原菌中，最常見的氨基糖苷修飾酶是AAC(6』)，使氨基糖苷類抗生素1—、3—、2』—或6"—位乙醯化，如今已發現16種編碼AAC(6』)的基因。銅綠假單胞菌和腸桿菌科細菌趨向於產生AAC(3)、AAC(6』)、ANT(2』』)以及APH(3』)；葡萄球菌和糞腸球菌經常產生ANT(4』)(4』』)或雙功能的AAC(6』)／APH(2」)。葡萄球菌對慶大黴素、卡那黴素和妥布黴素的耐藥性和腸球菌的高度慶大黴素耐藥性通常由雙功能酶介導，這些酶通常(但非總是)由位於多重耐葯質粒上的轉座子(Tn924)編碼，如葡萄球菌具有的轉座子Tn5405編碼的APH(3』)(提供卡那黴素、新黴素和阿米卡星耐藥性)，而其他的定位於染色體。越來越多的菌株可產生2種或更多種酶，對抗氨基糖苷類抗生素。在過去幾年裡常見的組合是慶大黴素修飾酶ANT(2』』)和AAC(3)]與AAC(6』)結合，導致對慶大黴素、妥布黴素、耐替米星、卡那黴素和阿米卡星的廣譜耐藥性。

　　氨基糖苷類抗生素對非發酵菌、腸桿菌科及一些革蘭氏陽性球菌均有很好的抗菌活性，與β—內醯胺類抗生素聯用有協同抗菌作用，在感染治療中佔有重要地位。但由於以上耐葯機制的存在，細菌耐葯問題也日趨嚴重，應該引起重視，可喜的是阿米卡星等對MRSA和產ESBLs菌株仍保持17％-40％的敏感率。

1、 青黴素結合蛋白(PBP)的改變導致的β—內醯胺類抗生素耐葯

　　青黴素結合蛋白(PBP)參與了肽聚糖合成的最後階段。高分子量PBP常常為多模塊，具有N末端糖基轉移酶區和C末端轉肽酶區。轉肽酶區的活性位點絲氨酸與酶的天然結構相仿，可與與β—內醯胺類抗生素髮生不可逆醯化。青黴素結合蛋白(PBP)的改變常導致如下兩種臨床重要的耐葯表型。

（1）耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus arueus,MRSA)

　　MRSA是20世紀60年代英國首先報道的一種嚴重的臨床耐葯致病菌,20世紀80年代以來，世界各地都相繼發生MRSA醫院感染的暴發流行，並逐年增多。MRSA耐葯分為固有耐葯和獲得性耐葯，固有耐葯是由染色體介導的，其耐藥性的產生是因為細菌產生一種特殊的青黴素結合蛋白PBP2a(或PBP2』)，分子量為78000的蛋白質，與β內醯胺類抗生素的親和力減低，從而導致細菌對β-內醯胺類抗生素耐葯。PBP2a由mecA基因編碼，95％以上的MRSA菌株能檢測到mecA基因，而敏感株則無。獲得性耐葯是由質粒介導的，細菌獲得耐葯基因後，產生大量β-內醯胺酶(而不是PBPs)，使耐酶青黴素緩慢失活，表現出耐藥性，多為臨界耐葯。

　　在MRSA檢測過程中，凡屬MRSA，不管其對其他β-內醯胺類抗生素MIC值或抑菌圈的大小，實驗室均應向臨床報告為對所有青黴素類、頭孢菌素類、碳青黴烯類、碳頭孢烯類和β內醯胺類—酶抑製劑複合製劑耐葯，以免誤導臨床用藥。MRSA感染的治療是臨床十分棘手的難題之一，關鍵是其對許多抗生素具有多重耐藥性，萬古黴素是目前臨床上治療MRSA療效肯定的抗生素，應用30多年來未發現耐葯菌株。新葯替考拉寧亦具有與萬古黴素相似的抗MRSA的活性。

（2） 耐青黴素肺炎鏈球菌 (Penicillin resistant Streptococcus pneumoniae,PRSP)

　　長期以來肺炎鏈球菌對青黴素高度敏感。MIC在0.005-0.01mg／L之間。1967年澳大利亞首次報道耐青黴素肺炎鏈球菌,MIC為0.5mg／L，此後世界許多國家和地區均有報道，且耐葯率迅速上升。PRSP的耐葯機制肺炎鏈球菌的青黴素結合蛋白(PBP)發生改變，使其與青黴素的親和力減低。肺炎鏈球菌有6種PBP：1a、1b、2x、2a、2b和3，其中PBP2b最為重要，如果青黴素結合到PBP2b上並使之抑制即導致細菌溶解和死亡；反之，PBP2b發生突變，青黴素不能產生作用，則導致PRSP。在PRSP高耐菌株中(MIC≥2μg／m1)可有多達4種PBP(主要是1a、1b、2x、2b)同時發生改變[7]。

　　肺炎鏈球菌是引起社區獲得性肺炎的重要致病菌。目前，國內PRSP的發生率在4％左右，明顯低於歐洲國家，在亞洲也屬於中等水平，且MIC多小於1mg／L，因此，在社區獲得性肺部感染病原菌中，PRSP尚不構成嚴重威脅，青黴素仍可作為首選治療藥物。但是耐葯沒有國界，中國日前PRSP發生率尚低．但決不意味著不要重視，而是應該進一步加強PRSP的耐葯監測。對於PRSP感染臨床治療推薦使用頭孢噻肟／頭孢曲松、新喹諾酮類（如司帕沙星)。若屬PRSP嚴重感染則需應用萬古黴素或加用利福平。

2、 DNA拓撲異構酶的改變引起喹諾酮類抗生素耐葯

　　喹諾酮類藥物的作用機制主要是通過抑制DNA拓撲異構酶而抑制DNA的合成，從而發揮抑菌和殺菌作用。細菌DNA拓撲異構酶有I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，喹諾酮類藥物的主要作用靶位是拓撲異構酶Ⅱ和拓撲異構酶Ⅳ。拓撲異構酶Ⅱ又稱DNA促旋酶，參與DNA超螺旋的形成，拓撲異構酶Ⅳ則參與細菌子代染色質分配到子代細菌中。革蘭氏陰性菌中DNA促旋酶是喹諾酮類的第一靶位，而革蘭氏陽性菌中拓撲異構酶Ⅳ是第一靶位。

　　當編碼組成DNA促旋酶的A亞單位和B亞單位及組成拓撲異構酶Ⅳ的parC和parE亞單位中任一亞基的基因發生突變均可引起喹諾酮類的耐藥性。在所有的突變型中，以gyrA的突變為主，佔80％左右，其次是gyrB、parC和parE突變。在所有這些突變類型中，若Ⅱ型拓撲異構酶上存在2個突變點(如gyrA和parC上)，它們引起對氟喹諾酮類的耐葯遠遠大於只有一個突變點(如gyrA或gyrB上)，前者是後者的3-4倍。同時沒有發現突變僅出現在parC基因這一現象。這可能是因為DNA促旋酶是氟喹諾酮類的重要靶位,gyrA亞單位的改變可引起酶結構發生變化致空間位障，阻止喹諾酮類進入喹諾酮類作用區，或引起物理化學變化，干擾喹諾酮與酶的相互作用。這些結果顯示gyrA上突變的出現是引起細菌對喹諾酮類發生耐葯的主要機制，而parC突變只是進一步引起銅綠假單胞菌對喹諾酮的高度耐葯。

　　DNA拓撲異構酶的改變是細菌耐喹諾酮類抗菌葯的主要機制，其他耐喹諾酮類的機制還包括後面將要談到的細菌膜通透性改變和主動外排機制。

三、細胞膜透性屏障和抗生素主動外排泵

　　細菌可以通過細胞壁的障礙或細胞膜通透性的改變，形成一道有效屏障，使得抗生素無法進入細胞內並達到作用靶位而發揮抗菌效能，這也是細菌在進化與繁殖過程中形成的一種防衛機制。這類耐葯機制是非特異性的，主要見於革蘭氏陰性菌。因為革蘭氏陰性菌細胞壁粘肽層外面存在著類脂雙層組成的外膜，外層為脂多糖，由緊密排列的碳氮分子組成，阻礙了疏水性抗菌葯進入菌體內。另外細菌外膜上還存在著多種孔蛋白，分子較大者為OmpF，分子較小者為OmpC，它們可形成特異性通道(OprD)和非特異性的通道(OprF)，作為營養物質和親水性抗菌藥物的通道。抗菌藥物分子越大，所帶負電荷越多，疏水性越強，則不易通過細菌外膜。細菌發生突變失去某種特異孔蛋白後即可導致細菌耐藥性,另外由於外膜蛋白OprF的缺失，使藥物不易通過而產生耐藥性。如銅綠假單胞菌特異性孔蛋白OprD2缺失即導致碳青黴烯類抗生素耐葯。

　　另外一種導致細菌非特異性耐葯的機制是細菌主動外排泵的存在，可以將進入細菌體內的藥物泵出膜外，從而逃避抗生素的作用。主動外排系統由於能特異地將進入細胞內的多種抗菌藥物主動泵出細胞外，導致細胞獲得耐藥性。如大腸埃希氏菌中的多葯外排泵AcorAB-TolC系統可以導致細菌對包括四環素、氯黴素、紅霉素、β—內醯胺類、利福平、氟喹諾酮類、氧化劑、有機溶劑、鹼性染料等多種結構不相關的藥物耐葯。銅綠假單胞菌的MexAB-OprM系統的主動外排作用也是導致銅綠假單胞菌固有的多重耐藥性的重要因素之一。

　　細菌的膜耐葯機制主要表現在銅綠假單胞菌的多葯耐藥性。銅綠假單胞菌幾乎囊括了包括膜耐葯在內的所有細菌耐葯機制，其耐葯已成為當前感染治療中較為棘手的問題之一，尤其值得重視和研究。

　　以上只是一些常見病原菌的耐葯問題，這些耐葯現象並非孤立存在的，臨床上可能會遇到多種耐葯菌或多種耐葯機制並存的複雜感染問題。另外在臨床實踐中，隨著感染病原菌的變化和變遷，新的細菌耐葯問題也會不斷湧現，如社區獲得性感染中耐氨苄西林的流感嗜血桿菌的上升，院內感染中逐年增多的真菌耐葯問題都有待進一步探討。

本文作者：南京醫科大學第一附屬醫院童明慶