肝癌相關標緻物高爾基體蛋白GP73的基因序列的克隆、表達、抗體製備及初步應用

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時間：2009-09-29　作者：解放軍三○二醫院臨檢中心　李伯安李波劉愛霞李永利馬洪濱郭靜霞毛遠麗　來源：本站　點擊量：1019

肝細胞癌（HCC）是世界上第五種最常見的癌症。2001年，全世界HCC的標化發病率為21/100,000，標化死亡率為20.2/100,000。我們可以看出，HCC的發病率和死亡率幾乎是一樣的，表明了這一腫瘤的預後是極差的。在2001年美國癌癥狀況國家年度報告中，HCC是過去十年中發病率增長最快的癌症^[2]。肝硬化是發展成為HCC的最重要的因素；因此肝硬化患者就成為了高危人群。預測，在美國接下來20年中，丙型肝炎（HCV）相關的HCC的發病率將會持續上升^[3]。考慮到美國肝硬化患者總體生存率的提高^[4]，和HCC患病率的持續增加，醫學界就迫切需要一種早期HCC診斷的有效方法。開發出一種敏感度和特異度更高的血清標誌物，用於危險人群的HCC早期診斷，就可能會提高這一致命癌症患者的生存率。

目前，甲胎蛋白（AFP）是唯一的推薦用於肝硬化患者HCC監測的血清標誌物。回顧性分析認為，AFP作為早期HCC監測工具，敏感度為39-64%，特異度為76-91%，陽性預測值為9-32%。另外，據報道，肝臟超聲用於臨床研究中早期HCC診斷時，具有78%的敏感度，91%的特異度，和73%的陽性預測值。然而，肝臟超聲的準確性是操作者依賴性的，這就限制了它的價值，從而不能作為一種監測性檢驗方法。這說明，我們需要一種更好的用於HCC監測的標誌物。

高爾基蛋白-73（GP73），最初被認為是一種滯留性的高爾基體II型跨膜蛋白，主要在許多人體組織的上皮細胞中表達。在正常的人體肝臟中，GP73隻在膽上皮細胞中表達，而肝細胞中則幾乎檢測不到表達。然而，臨床發現，在患有病毒性或非病毒性肝病的患者的肝細胞中，GP73的表達出現顯著的上調。一項最近的研究發現，可在人體血清中檢測到GP73，而且，與非腫瘤肝臟相比，在HCC旱獺模型中，血清和組織中的GP73濃度都上升了。因此，GP73將成為HCC早期診斷的標誌物。

為了建立一個形式化的框架用於指導癌症生物標誌物的評估和開發過程，美國國家癌症研究院的早期診斷研究網路採用了一個5期計劃[12]。1期生物標誌物開發研究的目的是（a）確定能否在肝病或非肝病患者血清中檢測到GP73，（b）確定HCC患者血清中GP73濃度是否比肝硬化患者的更高，（c）比較GP73和AFP的在區分HCC與非腫瘤慢性肝病時所表現的性能特徵。

我們根據報道的GP73全基因序列設計、合成巢式PCR引物，從HepG2細胞中分離出GP73的基因片段。將該片段克隆到pET-28載體中，經過核苷酸序列測定證明該片段與報道序列的同源性為100％。將該重組載體轉染至大腸桿菌BL21中，並誘導表達。經過蛋白電泳鑒定，重組體細菌裂解後可見外源基因表達帶，與預期片段大小一致。

細菌蛋白經純化後，免疫紐西蘭白兔製備多抗，同時按常規方法免疫Bablc小鼠，建立雜交瘤細胞系，製備單抗。並應用飽和硫酸銨法純化單抗。

將上述製備的應用多抗纖維素DE52純化後，採用改良過碘酸鈉法，用辣根過氧化物酶（HRP）標記純化的多抗。

將純化後的單抗按常規方法包被酶聯板，按常規ELISA方法，分別加入肝癌患者血清溫浴後，再加入酶標多抗溫浴後，加入底物顯色，建立血清了雙抗體夾心ELISA檢測GP73的方法，並證實單抗、多抗有共同的抗原結合位點。隨後應用標準矩陣實驗，確定ELISA實驗中的最佳包被、血清稀釋度及酶標抗體濃度確立ELISA檢測方案。

隨後，根據上述最終確立的ELISA實驗方案，對90例健康獻血員，92例慢性肝炎患者及68例HCC患者血清進行了檢測。結果顯示在獻血員、慢肝患者及HCC患者中GP73的陽性率分別為3.33％（3/90）、31.5％（29/92）、75.0％（51/68）統計分析表明各組間陽性率差異具有統計學意義。

通過實驗研究，我們獲得了與報道序列同源性為100％的GP73基因片段，並通過克隆、表達、純化獲得了GP73的原核表達片段。隨後我們通過免疫兔製備、純化了多抗，並進一步免疫小鼠後建立了雜交瘤細胞系後製備並純化了單克隆抗體。在標記了多抗後，我們建立了雙抗體夾心檢測GP73的ELISA方法。最後，我們檢測了健康人群、慢肝及肝癌患者血清中的GP73，發現各組間陽性率差異顯著。我們的研究為進一步確定對GP73在HCC早期診斷中意義，奠定了基礎。下一步我們將建立糖基化GP73的檢測方法（根據報道該異質體與肝癌的相關性更顯著），並進一步進行病理學及大規模的流行病學調查以確立GP73及糖基化的GP73在HCC早期診斷中的作用。