生物信息學100個基礎問題 —— 第34題 做RNA-Seq的數據分析邏輯是怎樣的？

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Hello 大家好！我們又見面了！

1. RNA-Seq專題相關問題

最近我們一直圍繞著RNA-Seq相關的專題在進行題設，我們不妨來回顧一下從BBQ100開始到現在若干個問題中與RNA-Seq有關的內容：

Mapping相關：

生物信息學100個基礎問題 —— 第23題 轉錄組的比對與基因組的比對有何不同？

GTF/GFF相關：

生物信息學100個基礎問題 —— 第24題 GFF，GTF到底是什麼？

生物信息學100個基礎問題 —— 第25題 GTF/GFF的注釋是怎麼來的，應該從哪裡下載？

RNA-Seq建庫相關：

生物信息學100個基礎問題 —— 第31題 RNA-Seq建庫用哪種策略？

生物信息學100個基礎問題 —— 第32題 1個RNA-Seq樣本到底要測多少序列？

生物信息學100個基礎問題 —— 第33題 什麼是鏈特異性的RNA-Seq？

那麼，截止到今天，我們已經掌握了基本的RNA-Seq實驗原理，但是怎麼去分析，為什麼去分析，這其中的內在邏輯其實我們還沒有涉及到。因此，現在的我們如果跟著BBQ100走到今天，可能會有一點霧裡看花的感覺。因此，今天我們的任務，就是為大家理清做RNA-Seq分析的思路。

2. 為什麼要做RNA-Seq？

先來談談為什麼要做RNA-Seq。假設我們沒有RNA-Seq技術，當我們看到經過某1個條件/刺激/處理以後，我們的研究對象，細胞，植株，亦或是可愛的小白鼠有了一些變化。這個時候我們通過觀察和實驗得到了1個判斷：

當對A進行B刺激的時候會出現表型C。

當有了這個判斷以後，正常的推理思路是，表型的出現很大可能是由於研究對象的蛋白含量的變化引起的。而蛋白的含量最直接的控制就來自於gene表達的變化。如果我們能夠有辦法測量A在進行B刺激以後全部的gene表達變化的gene list D，理應能夠得到下一個判斷：

當對A進行B刺激的時候會出現表型C，而這個表型C造成的原因很有可能是來自於D這些基因的變化。

但是這裡有個問題，這個刺激需要是一種比較穩定的條件，比如對細胞系進行穩定敲除（knock out）一個gene；再比對用藥物持續對植株進行噴洒等等。而不能是，我向細胞盤吐了口唾液，然後立即建庫去測RNA-Seq。這是因此，我們在推斷表型C造成的原因的時候，認為是gene的表達造成的，而從信號響應，到最終的gene表達的變化是需要時間的。因此，刺激以後，過一段時間以後才會出現變化，一般這個時間間隔是以小時為單位計算的。

因此，當我們認為表型C和刺激B之間是由於gene list D影響的，那麼我們就要做RNA-Seq。

3. 為什麼能做RNA-Seq？

那麼，我們為什麼能做RNA-Seq？貌似是一個很簡單的問題，其實不然，這是幾十年技術的積累。讓RNA-Seq能夠走進「尋常百姓家「的原因有很多，能輕而易舉想到的：測序費用的降低；基因組的公布/相關物種基因組的公布；分子生物學技術的成熟等等。

想像一下，如果有一天我們突然不能做RNA-Seq了，那麼我們再去想做我們判斷的檢驗就可要1個gene挨著1個gene的去做qRT-PCR了！或者是做價格和準確不不如測序的micro array檢測。

4. 拿到數據以後我們應該做點什麼？

還是回到我們之前的判斷：

* 當對A進行B刺激的時候會出現表型C，而這個表型C造成的原因很有可能是來自於D這些基因的變化

核心問題是找到這個gene list D，而這個問題的本質就是去尋找對A進行B刺激前後的差異。那麼差異又可以分成幾個方向去尋找：

方向1. 表達量的差異；方向2. 可變剪切的差異；方向3. 修飾的差異；方向4. 其他可能存在調控機制的差異；

針對不同的方向去尋找差異，方法也是不同的，比如方向1,2,3的分析方法就有非常大的不同。而選定方向以後，尋找差異的思路又可以擴展開：

1. 差異與whole genome相比是否有一定的分布傾向性？2. 差異是個例還是具有普遍性？（更換細胞系是否能重複？）3. 差異與表型是否有統計學相關性？... ...

當我們確定了方向與尋找差異思路以後，最後一步就是去展示分析結果，說直白些就是數據可視化。好的圖表可以讓人一眼就看出差異所在，不用文字就知道作者要表達的意思。數據可視化這方面，有非常多的工具可以使用比如R就非常方便。

5. 提問環節

1. 請對本文第4部分方向1,2,3進行舉例，比如通過XX條件，對XXX進行了XXX刺激，結果發現有若干gene的表達量發生變化，同時這些gene反映了XXX的生物學功能。需要給出paper的鏈接。
2. 出了上述3個方向，你能否再舉出其他可以用RNA-Seq數據進行探索的方向呢？

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