異檸檬酸脫氫酶及其突變體抑製劑在急性髓系白血病治療領域的研究進展（獨家原創）

專家介紹

尤啟冬：教授，博士生導師，國家「萬人計劃」教學名師，國家教學名師。現任中國藥科大學校學術委員會副主任、校學位委員會委員；江蘇省藥物分子設計與成藥性優化重點實驗室主任，天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室天然活性物質成藥性研究方向負責人，江蘇省「青藍工程」科技創新團隊負責人。社會兼職包括：擔任國家藥典委員會執行委員；中國藥學會理事、藥物化學專業委員會委員；江蘇省藥學會副秘書長、常務理事、藥物化學專業委員會主任委員；教育部實驗教學指導委員會委員；國際藥學聯合會規劃委員會委員，亞洲藥學院校理事會理事。此外，還擔任《中國藥科大學學報》副主編，《藥學學報》、《中國藥物化學雜誌》等13本雜誌的編委等職務；Journal of Medicinal Chemistry、Chinese Journal of Pharmaceutical Sciences、International Journal of MedicinalChemistry、Orphan Drugs: Research and Reviews等國際雜誌的編委；Journal of Medicinal Chemistry、PLoS One、Current Medicinal Chemistry、European Journal of Medicinal Chemistry、Bioorganic Medicinal Chemistry、Bioorganic Medicinal Chemistry Letter等著名國際學術雜誌特約審稿人。先後獲教育部霍英東優秀青年教師獎、江蘇省「五一勞動獎章」、「禮來亞洲傑出研究生論文導師獎」、第十一屆吳階平·保羅·楊森獎；享受國家政府特殊津貼，被評為教育部高等學校優秀骨幹教師、江蘇省有突出貢獻的中青年專家等；獲國家科技進步二等獎1項，省部級科技進步一等獎、二等獎等8項，國家教學成果二等獎3項、江蘇省教學成果特等獎2項，獲得江蘇省優秀課程、教學成果獎多項。著有《藥物化學》、Chiral Drugs: Chemistry and Biological Action、《手性藥物》、《手性藥物研究與評價》等著作、教材20餘本。

主要從事藥物分子設計與合成、藥物作用的分子機制和新葯研究等方向的工作，在活性天然產物的結構改造與優化、「蛋白-蛋白」相互作用調控劑、重大疾病關鍵調控節點的評價及藥物設計等方面開展了多年研究。作為課題負責人主持了包括國家「863」項目、國家自然科學基金重點項目及重大研究計劃項目、國家科技重大科技專項等在內的多項研究項目。目前已有4個候選化合物進入臨床前評價，1個國家一類創新藥物申報臨床研究，2個國家一類創新藥物正在進行臨床研究。發表SCI收錄論文260餘篇, 申請美、英、德、中等國家發明專利50餘項，其中授權專利28項。

正文

異檸檬酸脫氫酶及其突變體抑製劑在急性髓系白血病治療領域的研究進展

黃禾1，劉曉蓉2，尤啟冬1*

(1. 中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 210009；2. 南京聖和葯業股份有限公司研發中心，江蘇 南京 210038)

[ 摘要] 異檸檬酸脫氫酶（IDH）是人體代謝過程中重要的酶，參與三羧酸循環，催化異檸檬酸轉化為α -酮戊二酸（α -KG）。突變的IDH能催化α -KG 轉化為2-羥基戊二酸（2-HG），2-HG 不是體內正常的代謝產物，高濃度的2-HG 與急性髓系白血病（AML）及各種腫瘤的發生緊密相關。針對IDH 突變的抑製劑能顯著降低2-HG 的水平，成為一些腫瘤藥物開發的熱點。綜述IDH 突變在AML 和腫瘤中的作用及目前在研IDH 突變體抑製劑的研究進展。

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種發病率較高的惡性血液腫瘤，目前其治療方案以化療為主。對化療耐葯是AML 預後較差的主要原因之一，大部分AML 患者最終轉化成難治性白血病。近年來相繼發現的一些基因突變如核磷酸蛋白（NPM1）、FMS 樣酪氨酸激酶3（FLT3-1TD）、DNA 甲基轉移酶3A（DNMT3A）等，及其調控劑對AML 的治療具有重要意義。2008 年Parsons 等在對22 名惡性膠質瘤患者進行全基因分析時發現，12% 患者的異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase1，IDH1）基因R132活性位點存在突變。2009 年Mardis 等通過全基因測序首次發現AML 患者存在IDH1 突變。隨後多個研究報道了IDH 突變對AML 患者治療、預後等方面的影響， 突變IDH 作為一個全新的靶點成為該領域的研究重點。目前一些IDH 抑製劑取得了良好的治療效果，如伊那尼布（enasidenib）已獲美國FDA 授予治療AML 的孤兒葯資格。本文對IDH 及其突變體抑製劑在AML 治療領域的研究進展進行綜述。

1 IDH的生物學作用

IDH 酶家族廣泛分布於原核及真核生物中，在人體內IDH 家族主要包括IDH1、IDH2 和IDH3 3 種酶。根據異檸檬酸轉換成草醯琥珀酸過程中依賴的輔酶的不同， 可將IDH 分為2 種亞型：NAD- 依賴型IDH 和NADP-依賴型IDH。其中IDH1和IDH3 屬於NADP-依賴型IDH，IDH2 屬於NAD-依賴型IDH。IDH1 基因位於人類染色體2q33.3 位點，編碼的IDH1 蛋白主要存在於過氧化氫酶體及細胞質中。IDH2 基因位於染色體15q26.1 位點，編碼的IDH2 蛋白主要存在於線粒體中，IDH3 基因的位置尚未確定。大多數IDH 為同源二聚體，極少數以單體的形式存在，對於二聚體IDH，每個亞基均有一個活性中心。

異檸檬酸脫氫酶是三羧酸循環中重要的酶，其能將異檸檬酸轉化成草醯琥珀酸再進一步氧化成α-酮戊二酸（α-KG），在生物體內能量代謝過程中起重要作用。

除了轉化異檸檬酸成為α-KG 之外，IDH 還具有以下作用：1）在三羧酸循環過程中，IDH 提供的還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）能夠用於細胞中脂類物質的合成；2）過氧化氫酶體中的IDH 參與不飽和脂肪酸的降解過程；3）IDH 提供的NADPH 可用於體內抗氧化作用，NADPH 的增加可提高生物體的抗氧化能力，從而保護機體免受氧化損傷，延緩衰老過程。當IDH 出現突變，細胞會出現IDH 相關功能缺失，從而引發一系列問題，並且IDH 突變和腫瘤的發生有著緊密關聯。

2 IDH 突變與急性髓系白血病和其他腫瘤

2.1 存在IDH 突變的急性髓系白血病及其他腫瘤

AML 是髓系造血幹細胞惡性疾病，其主要特徵為造血幹細胞惡性改變導致正常造血功能喪失，成人預後較差。IDH1 和IDH2 基因突變常見於AML 患者，其突變率為15% ~ 30% 。與其他腫瘤不同，在AML患者中IDH2 突變比IDH1 突變的發生率更高，因此針對AML 的IDH2 突變抑製劑開發較多。

膠質瘤是常見的腦部腫瘤，Parsons 等 從膠質瘤患者中最早發現了IDH1 基因突變。人類80% 的二級膠質瘤和繼發性母膠質瘤患者存在IDH1 突變，而原發性膠質瘤患者的IDH突變率為3% ~ 16% 。同時，存在IDH 突變的膠質瘤細胞中普遍存在CpG 島甲基化的特徵。軟骨肉瘤患者的IDH 突變率為71%，去分化型軟骨肉瘤的IDH 突變率為57%。軟骨肉瘤中最普遍的突變為IDH1 基因R132C 位點突變，其次是IDH1 基因R132H 位點突變。

2.2 突變IDH 的特徵

突變的IDH 具有以下幾個特徵：1）IDH1 和IDH2突變主要發生在癌變的體細胞和少量生殖細胞中；2）所有腫瘤的IDH1 和IDH2 突變基因均為雜合型；3）體內IDH 突變均發生在活性位點的核心殘基上，幾乎所有IDH1 和IDH2 突變都存在一個氨基酸置換，IDH1中的Arg132、IDH2 中的Arg172 或Arg140 被Gln 或者Trp 替換，而這3 個殘基位於酶的活性位點上，因而突變對酶的活性有直接影響；4）在大多數情況下，IDH1和IDH2 突變的發生是相互排斥的，這一現象表明它們有共同的生化機制和生理作用。只有在很少情況下腫瘤細胞中同時出現IDH1 和IDH2 2 種突變；5）所有癌症相關的體內IDH突變，均引起了2- 羥基戊二酸（2-HG）水平提高，同時產生的D型異構體要比L型異構體多。

2.3 IDH 突變導致急性髓系白血病及其他腫瘤發生的機制

正常生理過程中，IDH 催化異檸檬酸轉化成α-KG，而IDH 突變會導致異檸檬酸不再轉化成α-KG，而是轉化成2-HG 。生物體內，2-HG 並沒有明確的代謝功能，體內代謝會產生低濃度的2-HG，這部分2-HG 會被迅速清除並轉化成α-KG。然而，突變IDH 產生的2-HG 濃度水平過高，無法快速清除並轉化成α-KG，導致2-HG 積累至很高濃度。細胞內高濃度水平的2-HG 會抑制組蛋白去甲基酶的作用和TET2（ten-eleven translocation 2）蛋白的活性，以及抑制調節細胞表觀遺傳狀態的酶，引起一系列癌基因、抑癌基因及信號傳導基因的異常表達，從而導致腫瘤的發生。同時，IDH 突變本身引起的代謝改變就會導致一些諸如氧化損傷的不良後果（見圖1）。

研究者們建立了一些老鼠模型用以表達位於造血組織中的IDH1-R132H 及IDH2-R140Q/R172K 突變基因。這些突變基因表達後，小鼠模型產生惡性血液系統腫瘤，被試驗的小鼠具有IDH 突變患者的特徵：脾腫大，貧血，組蛋白和DNA 甲基化模式的改變。對這些模型進行基因敲除，或者使用IDH 突變體抑製劑，可以減少2-HG 和腫瘤細胞，同時加強細胞分化。這些實驗表明IDH 突變在腫瘤抑制和發展中的重要作用。總而言之，IDH 突變通過表觀遺傳修飾，阻止了細胞分化，從而誘發了腫瘤細胞的產生和發展。雖然沒有根本原因能夠解釋IDH1、IDH2 突變和不同癌症亞型的關聯，但是兩種突變都產生了相同的新變體物質2-HG，以上事實表明2-HG 是功能型腫瘤代謝產物。

2.3.1 2-羥基戊二酸抑制脯氨酸羥化酶

IDH1 和IDH2突變削弱了IDH 對異檸檬酸的催化能力，導致依賴α-KG 的脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain，PHD）的活性降低，使其底物缺氧誘導因子-lα（hypoxiainduced factor-1α，HIF-lα）濃度升高。Chowdhury 等進行的體外研究顯示，2-HG 能夠抑制PHD 的活性，導致HIF-1α 水平的升高。HIF-lα 水平上調進一步增強其下游靶基因如血管內皮生長因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）的表達，VEGF 作用於血管內皮細胞表面的血管生長因子受體（VERFR）從而激活一系列的缺氧轉導通路，誘導腫瘤細胞中新血管的生成。VEGF 的表達增加，在腫瘤適應缺氧環境、能量代謝、血管新生及轉移中起重要作用。

2.3.22-羥基戊二酸抑制DNA 去甲基化酶和組蛋白去甲基化酶

TET 家族是調節DNA 去甲基化的主要酶類，該酶能夠催化5-甲基胞嘧啶轉化為5- 羥甲基胞嘧啶從而實現DNA 的去甲基化。Noushmehr等應用癌基因組圖譜檢測多形性膠質母細胞瘤患者發現，存在DNA過甲基化的患者中有78% 的患者存在IDH1 基因突變，而無DNA 過甲基化的患者中未發現IDH1 突變。該研究表明，IDH1 突變產生的2-HG 可能通過抑制去甲基化酶來促使DNA 甲基化，從而導致腫瘤的發生。組蛋白去甲基化酶是一種腫瘤抑製劑，與許多腫瘤的發生相關。有研究表明，2-HG 可通過競爭性抑制組蛋白去甲基化酶，導致一些癌基因和抑癌基因異常表達，從而影響基因的分化、增殖、轉錄調節等。

2.3.3IDH 突變導致氧化損傷

NADPH 是谷胱甘肽的轉錄因子的電子供體，在避免細胞氧化損傷上起重要作用。IDH 參與了細胞內氧化損傷的防禦機制，而在癌變細胞中突變IDH 降低或失去了此功能，IDH 突變導致NADPH 的消耗增加，使細胞更容易受到活性氧的損傷，引起細胞膜破壞、酶活性改變，同時DNA 受損傷導致基因組不穩定，由此導致腫瘤的產生和發展。

3 IDH突變體抑製劑

臨床前研究顯示，IDH1/2抑製劑對於膠質瘤細胞有延緩生長和促進分化的作用。AGI-5198是首個被報道的針對腦膠質瘤細胞IDH1 突變的抑製劑，其具有降低2-HG 水平及去甲基化的作用。IDH 突變體抑製劑在治療血液腫瘤過程中表現出較高的安全性、選擇性以及較好的治療效果，這些進展推動了IDH 突變體抑製劑在實體瘤等其他腫瘤治療領域的進一步開發，其中很多化合物目前已經進入臨床試驗（見表1）。

3.1 苯甘氨酸類

為了得到IDH1 小分子抑製劑，Popovici-Muller等針對IDH1/R132H 突變進行高通量篩選並發現，苯甘氨酸結構（1）的化合物2 對IDH1 突變具有抑制作用。在構效關係研究中，研究者們還對化合物2（IC50= 0.09 μmol · L-1）進行了一系列結構優化，分別用哌啶環、環丙基、苄基及環己基替代化合物2 的五元環（R1），結果顯示用環己基替換的化合物的IC50 降到0.05 μmol · L-1，但其他環替換的化合物IC50 均升至微摩爾水平；手性拆分後發現，S 構型的化合物具有更高的活性。苯甘氨酸類化合物R2 和R3 部分的研究結果並未公布，R4 部分用一系列雜環進行替換後得到的化合物，均有較高的活性，其中用咪唑環替換噻吩環得到的化合物3，即為AGI-5198。AGI-5198 由Agios 公司開發，是高效、具有選擇性的首個IDH1-R132H 突變抑製劑。AGI-5198 對R132H、R132C 及野生型IDH1 的IC50 分別為0.07、0.16、大於100 μmol·L-1，研究結果顯示AGI-5198 具有良好的選擇性。實體瘤小鼠動物模型研究結果顯示，AGI-5198 能明顯縮小IDH-R132H 突變小鼠的腫瘤體積。AGI-5198 能夠有效降低R-2-HG的水平，誘導組蛋白的去甲基化。

艾伏尼布（ivosidenib，AG-120，4）由Agios 公司開發，是一種口服有效、具有選擇性的IDH1 突變體抑製劑。艾伏尼布能有效減少IDH1 突變患者體內2-HG水平，抑制生長因子依賴的促紅細胞生成素（EPO）增殖，誘導人紅系白血病細胞（TF-1）分化。臨床前試驗顯示，艾伏尼布可阻礙IDH1 突變引起的功能異常，恢復正常發育，導致白血病細胞的有序死亡。關於艾伏尼布的劑量遞增臨床試驗正在繼續，用於複發/難治性AML 患者的劑量遞增臨床試已啟動。艾伏尼布目前正在進行血液系統惡性腫瘤（NCT02074839）以及晚期實體腫瘤（包括膠質瘤、膽管癌和軟骨肉瘤）（NCT02073994）相關臨床試驗。臨床數據顯示，艾伏尼布治療耐受性良好，尚未達到最大耐受劑量。

3.2 三嗪類

伊那尼布（enasidenib，AG-221，5）由Agios 公司開發，是一種口服有效、具有選擇性的IDH2 抑製劑。伊那尼布對具有IDH2R140Q 的白血病細胞株的IC50為100 nm。存在IDH2 突變的AML 患者中有80% 是R140Q 位點突變，僅有20% 是R172K 位點突變。伊那尼布能夠降低胞內2-HG 水平，逆轉DNA 和組蛋白超甲基化，對AML 有較好的療效。伊那尼布Ⅰ期臨床試驗（NCT01915498）的數據已公布，其結果和臨床前模型結果相符，受試者血漿和骨髓中2-HG 均迅速下降到正常水平，複發難治性白血病患者的完全緩解率為28.6%。伊那尼布和艾伏尼布聯合用於治療AML的臨床試驗（NCT02632708）目前正處在Ⅱ期臨床階段，伊那尼布針對AML 的治療已進入Ⅲ期臨床階段（NCT02577406）。伊那尼佈於2014 年6 月獲得治療AML 的孤兒葯資格，2014 年8 月份獲得治療AML 的綠色通道資格，2017 年8 月在美國獲批上市。

3.3 雜環磺醯脲類

AGI-6780（6）是高效、選擇性的首個IDH2 突變體小分子抑製劑。晶體結構分析顯示，AGI-6780 以變構方式通過氫鍵結合在突變IDH2/R140Q 二聚體口袋，AGI-6780 與谷氨酸殘基的醯胺形成的氫鍵作用使IDH2/R140Q 二聚體處於一種不適合催化的開放模式。在IDH1 和IDH2 酶中，該二聚體結合位點由4 個螺旋構成，其中2 個螺旋來自鏈A，另外2 個螺旋來自鏈B。因IDH1/R132H 口徑小，AGI-6780 無法進入因而對IDH1 的作用效果差，AGI-6780 對IDH2/R140Q 的IC50 為23 nmol·L-1。AGI-6780 能夠有效降低細胞系中IDH2/R140Q 產生的2-HG 水平，其EC50 為20 nmol · L-1，具有良好的選擇性。AGI-6780 能夠逆轉TF-1 細胞中IDH2/ R140Q 誘導的分化阻滯，其針對特定突變亞型產生特異性抑制活性，既不會抑制野生型酶，也不抑制其他的突變形式, 表現出較高的選擇性。

3.4 哌啶並吡唑類

GSK321（7） 是另一個通過高通量篩選得到的IDH1 抑製劑， 對IDH1/R132H、IDH1/R132C、IDH1/R132G 的IC50 分別是4.6、3.8 和2.9 nmol · L-1，對野生型IDH1 不敏感。目前尚無GSK321 抑制突變IDH2 的相關報道。晶體和生化研究結果表明，GSK321 結合在IDH1的變構位點，使酶處於一種無催化活性的構象。GSK321沒有直接接觸NADP+ 或突變132 位點的殘基，因此其能抑制不同類型的突變IDH1。在體內和體外試驗中，對AML 細胞給予GSK321 抑製劑的結果顯示， 2-HG 水平迅速降低，髓細胞分化阻滯被消除，GSK321 誘導了粒細胞的分化，能夠逆轉DNA 胞嘧啶的甲基化。

3.5 未公布結構的化合物

諾華公司研發的IDH1 抑製劑IDH305（NCT02381886）已進入Ⅱ期臨床階段，拜耳公司開發的IDH1 抑製劑BAY1436032（NCT02746081）也進入了臨床Ⅰ期研究。AG-881 是一個口服的IDH1 和IDH2 雙重抑製劑，臨床前研究顯示其可突破血腦屏障，有潛力成為腦膠質瘤患者治療的新選擇。目前AG-881 有2 項針對實體瘤和血液腫瘤的治療研究（NCT02492737、NCT02481154）處於Ⅰ期臨床階段。

4 結語

IDH1/2 突變與人類AML、膠質瘤及其他一些腫瘤的發生密切相關，目前這些疾病的治療仍面臨巨大挑戰。近幾年，IDH 突變體抑製劑針對存在IDH 突變的血液腫瘤和實體瘤表現出較好的療效。作為突變IDH1和IDH2 的底物α-KG 成為IDH 突變體抑製劑研究的重點之一，作為α-KG 競爭性抑製劑苯甘氨酸類化合物則表現出較高的選擇性。野生型IDH 和突變型IDH 在變構位點存在顯著差異，GSK321、AGI-6780 作為變構抑製劑同樣表現出較高的選擇性。目前AG-221、AG-881 和AG-120 等IDH 突變體抑製劑已進入臨床階段，其在促進細胞分化及抑制腫瘤發生方面表現出令人期待的效果。除AG-881 以外，目前IDH 突變體抑製劑均只針對IDH1 或IDH2 中一種突變進行治療，而在一些腫瘤細胞中，突變IDH1 和IDH2 可同時將α-KG 轉化成2-HG，因此開發更多可同時針對這2 個位點突變的抑製劑，以及聯合其他靶點開發出更安全、更高效、具有選擇性的藥物將會是未來該領域的研究重點。

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