淋巴瘤的規範化病理診斷-劉衛平

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2015年10月，國家衛生計生委醫院管理研究所正式啟動了全國範圍內的腫瘤病理規範化診斷培訓工作，旨在規範病理診斷，培養我國各級醫療機構病理專業人才，提升各級病理人員專業技術水平，從而提高醫療質量並更好地為患者服務。

項目培訓初期從腫瘤病理總論、淋巴瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌5個方面進行，由國家衛生計生委醫院管理研究所統一抽調專家分赴各地進行現場培訓，網路培訓部分則授權委託華夏病理網負責實施。

演講者：

四川大學華西臨床醫學院，劉衛平

文字整理者：

陝西省咸陽市中心醫院病理科，馬曉燕

視頻鏈接：

http://news.ipathology.cn/train/play/W0QQidZ11

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各位觀眾、各位聽眾，大家好！我們今天學習的內容是淋巴瘤的規範化病理診斷，這部分內容參加編寫的有復旦大學上海腫瘤醫院病理科的李小秋教授、北京友誼醫院病理科的周小鴿教授、第四軍醫大學西京醫院病理科的王哲教授和我。參加這部分審稿的還有很多國內的一些知名專家。

我們今天講課的內容主要是兩個方面。首先我們要學習一下關於淋巴增生性疾病的一些主要的診斷術語，主要有兩個；然後重點內容是淋巴瘤的規範化病理診斷，涉及3個方面的內容。

（一）我們先來看一下診斷術語。診斷術語有兩個，一個是淋巴瘤，一個是淋巴組織腫瘤。

我們首先看一下淋巴瘤。淋巴瘤無論是不是加了「惡性」，即無論是不是「惡性淋巴瘤」，我們知道淋巴瘤都是惡性的，沒有良性的淋巴瘤。淋巴瘤的定義是淋巴細胞及其前體細胞的克隆性增生而形成的一類惡性腫瘤。這個腫瘤可以發生在淋巴結，也可以發生在淋巴結外的其他它器官和組織，而發生腫瘤性增生的細胞成分就是淋巴細胞，包括B細胞、T細胞還有自然殺傷細胞。由於這些淋巴細胞也是機體的免疫系統的一個重要組成成分，所以說淋巴瘤也是機體免疫系統、免疫細胞發生的一類惡性腫瘤。

我們再來看一看淋巴組織腫瘤。淋巴組織腫瘤和淋巴瘤比較起來，相對來講概念上更為寬泛一些，它除了包括淋巴瘤以外，還包括淋巴組織裡面的其它一些成分發生的腫瘤，所以還包括一些良性的病變，即有一些良性腫瘤成分也包括在內。

下面我們看一下發生在不同器官的一些淋巴瘤的大體表現。這個圖我們可以看到是一個鼻的、也就是發生在中線面部的一個NK/T細胞淋巴瘤的大體表現；這邊這幅圖我們看到的就是一個小孩的霍奇金淋巴瘤的大體表現。這是發生在身體的不同器官的一些淋巴瘤：左上是乳腺的一個淋巴瘤，右上是一個脾臟的淋巴瘤，左下仍然是脾臟的淋巴瘤，（右下）這個是一個大B細胞淋巴瘤發生全身擴散的時候，出現皮膚多發性的結節性病變。

接下來我們看一些發生腔道器官的，主要是胃腸道的淋巴瘤。比如發生在胃的大B細胞淋巴瘤；發生在腸道的一些淋巴瘤，表現為一個息肉樣病變；這也是發生在腸道的一個淋巴瘤，表現為局部腸壁的瀰漫性增厚，同時有一個潰瘍性的病變；這個是發生在縱膈、胸腺原發的一個大B細胞淋巴瘤，表現為局部的一個佔位和分葉狀的結構，切面比較細膩。

這是來自我們四川大學華西醫院病理科的一個單中心大樣本的淋巴瘤病例的組織學構成分析。從這個構成圖我們可以看到：在所有的非霍奇金淋巴瘤裡面，我們這組病例最常見的是瀰漫大B細胞淋巴瘤，其次是結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤。這樣的一個淋巴瘤的構成和西方的一些報道有明顯的不同。接下來我們再看第二個數據：基因重排。免疫球蛋白和T細胞受體基因重排技術是用於檢測B細胞和T細胞的克隆性，協助我們對淋巴增生性疾病的病變性質作出判斷。在正常情況下，淋巴細胞在其分化的過程中發生抗原受體的基因重排，它的結果導致每一個淋巴細胞都有各自獨特的一個基因型，在這種情況下DNA的電泳上就表現為一個塗層，也就是「smear」。這樣的結果就提示是一個多克隆性增生。而淋巴瘤是淋巴細胞阻斷在某一個分化階段，在這個階段里這些細胞發生增殖，而增殖的所有這些子細胞和它的母細胞具有相同的基因編碼，擴增的DNA片段的長度也是相同的。因此，在DNA電泳圖上就形成一個單一條帶。這個就提示克隆性增生。基因重排的檢測從DNA的提取和擴增，然後最早是瓊脂糖電泳、之後是聚丙烯醯胺凝膠電泳、到現在通過毛細管電泳，從觀察條帶到觀察丰度，使基因重排這一檢測結果的準確性更加地好。

（二）接下來我們就來看看淋巴瘤的規範化病理診斷。我們從以下3個方面來進行講解。

首先是關於樣本取材和製備。淋巴增生性疾病的樣本主要有6類：1.淋巴結活檢樣本；2.結外器官或組織的切除或切取樣本；3.淋巴結或結外器官、或組織的鉗夾或空心針穿刺樣本；然後是兩類細胞學樣本：4.細胞學穿刺樣本；5.體腔積液的細胞學樣本；6.新鮮組織冷凍樣本。我們分別來看一下。

首先來看淋巴結的活檢樣本。它是大多數淋巴增生性疾病的病理診斷的主要檢材來源，因為淋巴結在人體內分布很廣，數量也最多，而且在發生淺表淋巴結腫大的時候很容易察覺，也往往是病人就診的一個很重要的原因。在淋巴結活檢樣本的檢查過程中，我們要特別注意選擇具有代表性的一個樣本。如果是多發性的淋巴結腫大，具有代表性的樣本是很重要的，一般來講要儘可能取比較大的；此外，要盡量保證將淋巴結完整地切除；如果不是單一部位的淋巴結腫大，不輕易去選擇腹股溝淋巴結做活檢，因為經常會有一些炎症性的因素對病變進行干擾，從而影響我們的診斷。淋巴結樣本切取以後，我們要對它進行適當的切分，來滿足後繼的淋巴增生性疾病的輔助診斷的檢測需求以及研究的需要。這個病人就是一個淋巴結腫大的完整淋巴結切除樣本，可以很清楚地看到淋巴組織的構象，這是很理想的一個樣本。對樣本的切分處理有一個推薦方案。對於絕大多數的淋巴增生性疾病，通過對樣本的恰當切分，我們有足夠的樣本用於常規的形態學和免疫組織化學染色，90%的淋巴增生性疾病通過這樣一個環節，就可以完成它的診斷和組織學分型。有少數的病例需要藉助於其他的一些輔助檢查手段，包括基因重排檢測、原位雜交檢測或者是熒光原位雜交檢測以及特殊染色來幫助我們完成進一步的診斷，而留下來的一部分標本，我們根據各個實驗室的具體情況可以做實體瘤的流式細新胞術檢查，以及實體瘤細胞遺傳學檢查，還有一部分標本可以留在後繼的一些方法或者分子生物學方面的一些研究等。

第二個樣本類型是器官和組織的切除或者切取樣本。這樣的樣本實際上是發生在身體的不同器官組織的一些病變，它和發生在這些的一些器官和組織的其它的、非淋巴造血組織的疾病是無法區分的。所以對於這樣一些器官組織的切除或切取樣本，遵照我們病理技術操作規範總的原則和各個醫院病理科的一些標本取材的遊戲規則來進行。

第三個方面的樣本是空心針穿刺或鉗夾樣本。原則上不推薦使用空心針穿刺來作為淋巴增生性疾病的病理診斷和分型的首選方法。但是這種穿刺活檢如果提示是一個淋巴組織腫瘤的時候，我們應該首先建議病人盡量做病變樣本的切除或者是切取活檢。有些情況下，比如有些病人身體很虛弱，或者一些老年人不能夠勝任或者接受手術取材；還有一些比較深部的病變，比如縱膈、腹膜後，或者是腹腔的一些病變，不太容易通過一般的手術來進行活檢，不得不選擇穿刺。在這種情況下，我們需要結合形態學、結合相關的免疫組化染色以及其他一些輔助檢測手段，也還是可以完成淋巴瘤的診斷和組織學分型，這裡給大家舉個例子。我們的這個病例是一個50歲的女性病人，腹膜後佔位，因為位置很深，所以是在影像學引導下的一個穿刺活檢，我們看到是一些不整形的碎組織。這樣一個組織我們拿到以後可以看到在纖維組織裡面有密集增生的異型淋巴細胞，體積中等大小或者中等偏大，在纖維組織內浸潤，部分區域有明顯的擠壓。在這樣一個病例，我們根據形態學提供的線索選擇一組免疫組織化學染色標記來進行檢測，可以看到這些異型增生的細胞表達B細胞分化抗原、表達CD20，提示是一個B細胞的腫瘤。同時我們也可以通過其他一些免疫組織化學染色了解到這個B細胞腫瘤的免疫學亞型以及細胞增殖的情況和預後相關的一些標記的表達情況。結合形態學和免疫組織化學染色的結果，我們可以對這個腫瘤進行診斷並且分型。我們可以看到這是一個瀰漫性大B細胞淋巴瘤，高增殖活性，並且這個腫瘤細胞還是bcl-2和c-myc蛋白雙表達的。所以我們要建議做熒光原位雜交檢測。

我們再看看細胞學樣本。主要有兩類，一個是體液的細胞學樣本，另一個是穿刺細胞學樣本。這類樣本一個最重要的原則就還是不適合於做淋巴組織腫瘤的病理診斷和分型。但是有些病人可能沒有明顯淋巴結腫大，或者沒有組織和器官的佔位，這種情況下，這樣的樣本也可以完成淋巴組織增生性疾病的診斷。比如說一些富於細胞的體液樣本，我們可以通過細胞的富集做成細胞塊。做成細胞塊以後就和常規的石蠟組織切片一樣，可以進行後面的免疫組化、分子檢測等各方面的很多工作。這個病例我們可以看到一個體液的細胞學樣本，裡面有大量的淋巴細胞成分；這是腹水裡面我們看到的一些異型淋巴細胞；這是富於細胞的一個腹水的樣本，我們先把細胞富集，然後做成細胞塊，可以對細胞形態進行很好的觀察，同時可以做後繼的一些工作；這是給大家看的一個病例，79歲的一個男性病人，是一個胸水，胸水裡面有大量的淋巴樣細胞，這些細胞基本上都是一些中等大小的，而且形態比較一致；這就是這個病例的胸水細胞進行富集以後做成的細胞塊、然後做成的切片，我們看到這些腫瘤細胞的形態就更為清楚，而且細胞的一致性也非常好，考慮可能是一個淋巴增生性疾病，那麼選擇一組抗體來進行工作。做下來我們可以看到細胞優勢表達CD20，提示是一個侵襲性的B細胞腫瘤，而且這個腫瘤仍然是一個雙表達，我們看到有bcl-2和c-myc的高表達。其中bcl-2的閾值是50%，c-myc是40%。從漢斯分型相關的MUM-1、bcl-6和CD10這3個標記來看，這個細胞表達了bcl-6和CD10，所以提示是一個生髮中心細胞來源的腫瘤。我們還可以在這個細胞塊上做熒光原位雜交檢測。這個病例我們可以看到通過熒光原位雜交檢測，檢測到了這個病例有myc基因和bcl-2基因的斷裂；同時也可以用這樣的樣本做基因重排檢測，最後完成我們的診斷。這是在細胞學樣本上通過細胞塊進行後期的輔助工作完成了淋巴瘤的診斷和分型。按照修訂的WHO分類，這是一個高級別的B細胞腫瘤，伴有myc和bcl-2的易位。

手術中冷凍切片的病理檢查。一般在臨床到懷疑淋巴增生性疾病的情況下，不會選擇手術中冷凍切片病理診斷來明確病變的性質。往往是在臨床上的某個器官或者組織的佔位性病變，但是在冰凍檢查的過程中發現是、或者可能是淋巴增生性疾病。那麼在這種情況下我們要注意的問題就是兩個，第一要告知臨床醫生，這個可能是一個淋巴增生性疾病，避免臨床上對這個組織或者器官的過度治療，比如一些致殘性的手術，如發生在喉的、乳腺的、前列腺的一些標本。另一個方面要告訴臨床醫生，儘可能再取一點組織，不要做冷凍檢查，只進行常規的病理檢查。這樣的標本它的組織保存（包括蛋白和核酸保存）得比較好，可以滿足後續的免疫組織化學染色、分子檢測的需要。這兩點是最重要的。大家看我們的一個病例，五十幾歲的男性病人，顱內的佔位病變。從冷凍檢查來看是一個富於細胞的病變。高倍鏡下看到這些細胞比較密集，細胞形態不太規則，有一定的異型性。那麼它到底是一個膠質細胞腫瘤或者其他腫瘤、還是一個淋巴組織腫瘤呢？當你懷疑到淋巴組織腫瘤的時候，要給臨床一個提示，剛才已經講了的兩個方面。那麼後期的免疫組化染色提示這是一個發生在中樞神經系統、發生在顱內的大B細胞淋巴瘤。

接下來我們來看一看樣本的標識。樣本的標識要符合國內相關的行業規範和總則裡面所提到的一些要求，現在比較重要的是要強調雙標識，雙標識的目的就是確保樣本的唯一性和確保在標識的過程中不出現導致一些差錯的發生。雙標識應該貫穿在病理標本的整個過程中，從大標本到蠟塊、到切片，都要進行雙標識。可以作為雙標識的信息有這樣一些，包括患者的姓名、編號、住院號或者登記號以及患者的身份證號。一般來講，用前面3個的幾率是比較高的。

接下來我們看看樣本的處理和製片。樣本的處理遵循的是總則所講的一般原則，固定用的是4%的中性甲醛溶液，樣本與固定液的體積比要求是1:4，固定液的量應該是樣本量的4到10倍。固定時間根據標本的大小不同要求6-48個小時，至少要有6個小時。對於淋巴增生性疾病的標本，由於它的細胞成分比較豐富，間質成分比較少，切片宜薄不宜厚。整個製片過程的質量控制和總則的要求是完全一樣的。對於淋巴增生性疾病的診斷，我們還是要強調高質量的HE切片是非常重要的依據。在高質量的HE切片，可以很好地觀察病變組織的形態、構象，比如這是一個反應性增生的淋巴結，我們可以看到淋巴濾泡的分布：濾泡、濾泡間區、竇和索的分布情況。在高倍鏡下可以很清楚地觀察到細胞的細微形態，包括細胞核、細胞質、核的整個的結構等等，這是非常重要的。再看這樣一些質量很差的HE切片：有一些刀痕；有一些組織的缺失；染色的情況也很差、不透明，就是我們經常說的「打不穿」，這就很影響淋巴組織疾病的診斷。

再接下來我們來看看病理檢查申請表。病理檢查申請表對於淋巴增生性疾病除了滿足共性方面的要求而外，需要提供跟淋巴增生性疾病相關的一些臨床和實驗室檢查以及影像學檢查的結果，包括血象即血常規、骨髓穿刺或者是活檢的結果、骨髓或者外周血的流式細胞術檢查結果、影像學、還有其它比如分子檢查的結果。每個單位的病理科都有根據自己科室的情況設計的病理診斷申請表。

前面我們講了樣本的製備，接下來我們來看看淋巴瘤的規範化病理診斷方面的內容。淋巴組織腫瘤的病理診斷主要是要通過對病變組織的活檢來確定診斷，所以對於淋巴組織腫瘤的病理活檢和組織學診斷及分型要採用國內或國外公認的或者是通用的標準，這個是比較重要的。從第4版的WHO分類就已經提出了淋巴組織腫瘤病理診斷的四結合原則，也就是形態學、免疫表型、分子和細胞遺傳學以及臨床表現的四結合。對於我們一些基層的醫院，如果不具備淋巴增生性疾病的病理診斷條件的情況下，最好就是送上級醫院，或者送有條件的醫院進行會診。我們看到的這個是WHO關於淋巴造血組織腫瘤的分型的藍皮書。這是2008版、第四版的藍皮書。在所有的WHO分類裡面，淋巴組織腫瘤病理診斷的藍皮書在國際上的接受度是比較高的，無論是國內還是國外、無論是臨床還是病理醫生。這是2016年、去年才發表在《Blood》雜誌上發表的一個修訂的WHO關於淋巴組織腫瘤的分類，而第五版的分類也許在今年就要出台。這就是我們講到的淋巴組織腫瘤病理診斷的四結合原則。形態學包括一般的、比如淋巴瘤或者淋巴增生性病變的基本病理病變，也包括發生在不同的器官組織和不同組織類型的淋巴瘤表現出來的一些特殊的形態學特徵。免疫表型我們可以通過免疫組織化學染色、免疫細胞化學以及流式細胞術這樣的一些檢測手段來進行。分子遺傳學方面可以做免疫球蛋白或者T細胞受體的克隆性性分析，也可以做一些特殊的基因異常的檢測，如通過FISH平台或者是PCR-best這樣一些方法來進行檢測。臨床表現仍然是淋巴增生性疾病的共性表現，比如發生在淋巴結表現為局部淋巴結的無痛性進行性腫大；發生在不同的器官和組織的淋巴增生性疾病有其個性的表現，這也是我們需要掌握的一些內容。

首先，我們來看一看形態學方面的觀察。形態學方面觀察對於病理診斷是非常重要的。實際上不光是淋巴增生性疾病，所有的疾病形態學觀察都是病理診斷的第一步，對於淋巴增生性疾病尤為重要。這樣的形態學觀察可以提供或者是幫助我們發現某一些淋巴瘤的組織學類型的有用的、或者是有價值的、或者有參考價值的線索，同時也是我們選擇輔助檢查的一個非常重要的依據。比如說選擇免疫組織化學染色，選擇哪樣的一些抗體、選擇哪樣一組抗體，都是基於形態學的觀察來進行的。這樣的一些輔助檢查完成以後，最後我們要整合，和形態學的觀察要結合起來對這個腫瘤進行診斷和分析，準確地解讀輔助檢查結果也離不開形態學。所以說形態學觀察和分析，不但能夠為淋巴瘤的診斷提供重要的線索，而且也是通向正確診斷的一個有效途徑。我們看一看形態學觀察要觀察哪些方面的內容。形態學觀察我們要觀察3個方面的內容。1.腫瘤細胞的生長方式，到底是結節性的、瀰漫性的、間區的或者是混合性的生長。2.腫瘤細胞的形態、細胞的大、小、細胞的異型性的情況，還有這些增生和浸潤細胞的一致性情況，是單形性的、還是多形性的。3.伴隨病變。這個腫瘤是不是伴隨有出血、是不是伴隨有壞死、伴有纖維化或者其它的一些改變。這是我們要觀察的一個內容。首先來看一看，這是一個淋巴結的切除活檢樣本，在低倍鏡下，我們可以看到這個病變形成了一個境界不是那麼清楚的、有一些模糊的結節樣的結構，這是一個構象；這個也是一個淋巴瘤，我們看到這些腫瘤細胞是呈瀰漫性的增生和浸潤，沒有什麼特別的構象；這個我們看到也是腫瘤細胞呈這種瀰漫性增生和浸潤，但是這些腫瘤細胞之間有一些組織細胞成分而形成了所謂的「star sky」，也就是星空現象。觀察構象是第一個方面，第二方面我們就要觀察細胞的大小。細胞的大小主要是參照兩個方面，一個是腫脹的血管內皮細胞，還有一個是組織細胞的細胞核，大概是10μm左右。比腫脹的血管內皮細胞或者是組織細胞的細胞核小的就是小型，一般我們說的小型大概是7μm左右、7-8μm。這是一個慢性淋巴細胞性白血病的病變；這個是大細胞型，是一個最常見淋巴瘤類型，即瀰漫性大B細胞淋巴瘤的腫瘤細胞，都是中心母細胞樣的細胞，「centroblast-like」，這些細胞的核是圓形或卵圓形的，核染色質是拉空的，可以看到1-3個核仁，多數是貼著核膜；這個也是一個大B細胞淋巴瘤的病例，我們除了看到一些中等大小的或者中等偏大的細胞，還看到散在分布的一些異形細胞。這些細胞的體積很大，這是瘤巨細胞。在所有的非霍奇金淋巴瘤裡面，最容易看到瘤巨細胞的就是瀰漫大B細胞淋巴瘤。這個大家一看就知道是一個經典型霍奇金淋巴瘤的病例，這個腫瘤的特點就是在背景裡面有大量的非腫瘤性的細胞成分：一些小淋巴細胞、組織細胞、大量的嗜酸性粒細胞，而腫瘤細胞是散在分布於病變組織中。這個地方可以看到腫瘤細胞的一個病理性分裂。這是它的細胞形態。在某些淋巴瘤我們也可以看到這種很典型的、叫做血管中心性浸潤的情況。血管中心性浸潤在很多淋巴瘤都可以出現，包括T細胞的、B細胞的以及NK細胞的一些腫瘤。淋巴上皮病變也常常是一些黏膜相關淋巴組織淋巴瘤的一個常見的形態學表現，它表現為腫瘤細胞在粘膜內的灶性聚集性浸潤，同時有粘膜或者是上皮的破壞，這樣的一個形態學改變我們通過CK的免疫組織化學染色就可以很好地勾勒出這種上皮的殘缺和淋巴細胞的浸潤情況。這些我們可以看到是腫瘤細胞在血管內的分布情況；這個是在肝脾T細胞淋巴瘤里，腫瘤細胞在肝竇裡面分布的情況。第三個方面的觀察就是伴隨病變。我們在淋巴瘤經常可以看到有不同程度的壞死改變；這個呈地圖樣的壞死；這是一個伴隨病變，是一個漿細胞的腫瘤，看到有一個血湖，就是「blood-lake」；澱粉樣變在B細胞的腫瘤和漿細胞的腫瘤里我們經常會遇到，這是一例漿細胞骨髓瘤的屍體解剖病例；這是胰腺的一個組織切片，我們看到胰腺小葉的結構還是比較清楚，在胰腺的間質裡面、血管壁上和血管周圍可以看到剛果紅染色呈橘紅色的物質，同時也可以看到這樣一些紅染的無定形物質，周圍有多核巨細胞的浸潤，形成一個異物肉芽腫的反應。這種澱粉樣變我們通過剛果紅染色是要在偏光顯微鏡下來進行觀察它到底是不是陽性。在偏光顯微鏡下觀察呈這種所謂的蘋果綠色「apple green」的，就提示是剛果紅染色陽性。

輔助檢查。實際上在淋巴增生性疾病裡面，有這麼多的輔助檢查可以用，但是最常用的還是免疫組織化學染色，其次是基因重排檢測，這是用的最多的。我們首先來看一看免疫組織化學染色。免疫組織化學染色已經是淋巴組織腫瘤的病理診斷和分型必不可少的一個手段了。但是在免疫組織化學染色抗體的選擇裡面，我們特別要注意是要選擇一組抗體，這一組抗體包括了涉及到診斷和鑒別診斷相關的一些內容。當然，免疫組化染色的質量控制是非常重要的，要保證免疫組化染色的質量，有效的質控是不可或缺的。免疫組化染色在淋巴組織腫瘤診斷中的應用主要是有這麼幾個方面。1.可以幫助我們明確或者是了解這個腫瘤細胞的屬性，即這腫瘤細胞到底是哪些淋巴細胞來的，是T嗎、B嗎、NK嗎或者其他的一些細胞。2.可以幫助我們了解腫瘤細胞所處的分化階段，比如前體細胞的一些腫瘤常常會表達CD34、CD99、TdT這樣一些標記。3.幫助我們了解特徵性的遺傳學改變，比如濾泡性淋巴瘤會出現bcl-2的高表達，套細胞淋巴瘤會出現cyclinD1的高表達。4.有助於我們區別是一個淋巴瘤還是一個反應性淋巴組織增生。這主要是在淋巴結的濾泡增生和濾泡性淋巴瘤的區別中，bcl-2染色在其中有非常重要的作用。5.指導分子靶向治療。大家知道美羅華對於CD20（陽性B細胞淋巴瘤的靶向治療作用）。這是一個B細胞的腫瘤，CD20染色是細胞膜的線性陽性反應；這個是一個漿細胞瘤，做的是免疫球蛋白輕鏈的染色，從染色結構來看，這邊是κ，這邊是λ，可以看到是κ輕鏈的絕對限制的一個染色，提示有克隆性的增生；這個就是一個前體淋巴細胞的腫瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤，這個腫瘤細胞表達TdT，要注意的是實際上不光淋巴母細胞性淋巴瘤表達TdT，還有其它的一些(包括髓系的)腫瘤也可以表達TdT；這個是一個淋巴組織的結節狀增生，那麼它到底是一個濾泡性淋巴瘤呢，還是一個濾泡的反應性增生？我們可以通過bcl-2染色來幫助我們進行區別：當是一個腫瘤性的濾泡的時候，我們看到結節內或者濾泡內這些細胞都表達bcl-2的抗原，而反應性增生的濾泡的生髮中心這些細胞bcl-2是不表達的，也就是bcl-2陰性，而周圍的套區和邊緣區的細胞表達bcl-2，所以形成兩個完全不同的模式：這個是濾泡性淋巴瘤的模式，這個是反應濾泡增生的模式。在免疫組化染色結果的解讀過程中，我們需要注意的問題就是，一要了解所選擇的這個抗體的表達譜的情況、陽性信號的定位，這個是非常重要的。二要了解這樣的一些抗體的免疫組織化學染色在所要觀察的那些細胞的定位情況。這是兩個很重要的因素。我們也推薦了一些常見的淋巴組織腫瘤常用的一些抗體組合，大家在日常工作中可以參考。

我們綜合起來看一下——比如以最常見的大B細胞淋巴瘤為例——我們對於淋巴瘤的綜合病理診斷的過程。我們通過活檢的樣本了解到或者是獲得了這個線索，覺得是一個非霍奇金淋巴瘤或者是一個大細胞型的淋巴瘤、大B細胞淋巴瘤的可能性大。那麼在這種情況下，我們選擇了一組抗體，這組抗體涉及到細胞的屬性，比如CD20；然後涉及到它的免疫分型，現在比較通用的、操作性比較好的還是漢斯分型的3個標記：CD10、bcl-6和MUM-1；涉及到細胞的增殖活性Ki-67，還有預後相關標記，每個醫院、每個地方有一些不同，但是對於大B細胞淋巴瘤最重要的是：我們要注意bcl-2和myc蛋白的表達。在修訂的WHO分類裡面已經明確提出了對於大B細胞淋巴瘤的病理診斷里，我們需要回答的一個問題就是它是不是雙表達的問題，所以bcl-2和myc是必須選擇的。再一方面，我們對所有的大B細胞淋巴瘤都建議或者推薦做EB病毒原位雜交的檢測。通過這樣一個工作，我們也發現實際上EB病毒陽性的大B細胞淋巴瘤遠遠比我們想像的多。

在免疫表型檢測的基礎上，我們要選擇一部分病例做進一步的基因檢測，這中間比較重要的一些提示線索有這麼幾個：1.高增殖指數，即腫瘤細胞增殖指數大於80%，這是我們推薦的一個「cut off」值；2.腫瘤細胞有myc易位、有myc的高表達，或者是c-myc和bcl-2的雙表達，這樣的一些因素建議要做分子檢測。小B細胞淋巴淋巴瘤也是如此。根據形態學的觀察，我們選擇了一組panel，涉及到了小B細胞腫瘤的組織學亞型的診斷，必要的時候我們要進行基因檢測。對於濾泡性淋巴瘤，我們做bcl-2易位的檢測，百分之八十幾是bcl-2的易位，但還有百分之十幾的是bcl-6的易位。CyclinD1是CCND基因易位以後導致cyclinD-1蛋白的過度表達，這是套細胞淋巴瘤的特徵，但是有些套細胞淋巴瘤可能不表達cyclinD-1而可能是cyclinD-2的易位，所以這個是我們在這類腫瘤診斷中要注意的問題。MALToma，黏膜相關淋巴組織淋巴瘤。對於胃的黏膜相關淋巴組織淋巴瘤的診斷，現在推薦都應該建議病人做API2/MALT1易位的檢測，而對於慢性淋巴細胞白血病這類腫瘤，實際上基因檢測跟診斷是沒有關係的，主要是跟病人的治療和臨床的分層是有關係的，所以臨床要求的話做的比較多。

免疫表型檢測完了以後，我們看看基因重排的分析。基因重排分析我們要注意的主要是兩個方面的問題，第一個方面的問題就是什麼時候選擇做基因重排檢測，第二方面就是基因重排檢測裡面我們要注意的問題。首先來看什麼時候需要進行基因檢測。一般來說有這5種情況下需要做基因檢測：一病變的活檢組織很小，比如腔鏡活檢或者是鉗夾活檢、穿刺活檢這樣一些很小的組織，它的形態學信息很有限。二是一些混合性淋巴細胞增生病變，也就是形態學觀察我們看到病變組織裡面既有T、又有B細胞的一個混合性增生，單純憑形態學或者形態學加免疫組化表型檢測以後，仍然不是那麼容易判定它的問題細胞成分的時候，我們需要藉助於基因重排檢測。三是皮膚的淋巴增生性疾病，我們也是經常需要做基因重排分析。四是懷疑為結外邊緣區粘膜相關淋巴組織淋巴瘤的病例也是需要的。最後是有一些病例經過免疫表型檢測以後，我們觀察到的這樣一些問題細胞既不表達T細胞標記，也不表達B細胞標記，就是我們所說的「null cell」裸細胞，這種情況也是需要進行基因重排檢測的。這是什麼時候、或者哪些情況下需要進行基因重排檢測。大概有10%到20%的淋巴增生性病例需要藉助於基因重排檢測幫助我們判定病變性質。在基因重拍檢測選擇了以後，結果出來我們對它分析的時候又需要注意一些問題，不是說基因重排檢測陽性就一定提示它是一個腫瘤性的增生，這一點要特別明確。這些結果必須要整合：和形態學整合、和免疫表型整合，然後進行一個綜合的分析。一般來講有這麼3個方面，一是免疫球蛋白基因重排並不僅限於B細胞，T細胞受體基因重排並不僅限於T細胞，不是這麼個情況。我們看到有些T細胞的淋巴瘤可以出現免疫球蛋白的基因重排，但是它有一定提示。如果這個病例只有免疫球蛋白的基因重排，或者只有T細胞受體基因重排，它可能提示是一個腫瘤細胞系。但是像剛才我們說的，如果同一個病裡面既檢測出了免疫球蛋白基因重排又檢測出T細胞受體的時候，只能說明這裡面這兩類細胞的克隆性增生。二是基因重排結果的解釋。對於小組織特別是鉗夾組織、穿刺組織這樣的病例，做基因重排分析的時候呢，也就是我們可能會遇到這種情況，比如一個胃鏡的活檢或者腸鏡活檢。它是一個B細胞的優勢增生，我們看到裡面大量的B細胞，背景裡面還是有一些少數的T細胞成分。但由於這個T成分數量太少了，沒有辦法形成一個多克隆的背景的時候，這樣的一個標本做檢查的時候可能就會出現除了檢測出免疫球蛋白基因重排，同時還會檢測出T細胞的克隆性重排。這種它可能是一個類似於克隆或者寡克隆的PCR的產物，這個時候會干擾。但是這樣的一個結果必須得結合形態學、結合免疫表型的分析，然後綜合來判斷，這個就非常重要。當然，分子檢測質量控制也是保證檢測的準確性的一個非常關鍵的因素，是不容忽視的。

這是我們的基於PCR的一個分子檢測平台；熒光原位雜交也是在淋巴瘤的診斷中經常使用的一個技術，這是我們的熒光原位雜交平台，它主要是兩個方面構成，一個方面就是實驗操作平台，另外一方面就是結果的分析和觀察的平台、一個觀察的系統。熒光原位雜交技術、即FISH技術在淋巴增生性疾病診斷中的應用主要是有這麼幾個方面：一是幫助我們確定一些有特徵性的遺傳性改變的淋巴瘤的類型。比如Burkitt淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、間變大細胞淋巴瘤、ALK陽性大細胞淋巴瘤等等。二是協助診斷一些特殊類型的淋巴瘤。現在比較多的主要還是這種在修訂的WHO分類裡面提到的所謂的高級別B細胞淋巴瘤伴有c-myc或bcl-2或者還有bcl-6易位的這樣一些腫瘤的診斷。三是跟治療和預後相關的，我們用的比較多的，比如說對於小淋巴細胞性的淋巴瘤或者是慢性淋巴細胞白血病的一個套餐檢測。這樣的一些細胞遺傳學方面的改變或者是這樣的一些基因的異常，跟這個腫瘤的分層、治療是密切相關的，還有漿細胞腫瘤等等。

以大B細胞淋巴瘤為例——因為大B細胞淋巴瘤是最常見的非霍奇金淋巴瘤的類型——什麼時候我們需要做FISH呢？也是有3種情況：臨床表現為一個侵襲性的腫瘤，比如說高IPI指數；或者原發中樞神經系統淋巴瘤；或者伴有骨髓累及。從病理方面來看主要基於3個方面，一是這個腫瘤的形態學，二是這個腫瘤的高增殖活性，Ki-67指數大於80%，三是腫瘤表達c-myc蛋白或者c-myc、bcl-2蛋白的雙表達。這些都提示需要做FISH即熒光原位雜交檢測。儘管現在的一些研究認為，對於大B細胞淋巴瘤而言，雙表達和雙打擊二者是互不相干的，但是我們還是發現有部分病例既是一個雙表達淋巴瘤，同時也存在著雙打擊或者三打擊的情況，所以說還是需要做的。從臨床角度來看的話就是流式細胞術檢查，腫瘤細胞是CD38bright和CD20dim、也就是C20弱表達的，這樣的一些腫瘤也是建議做FISH檢測的。

下面是病原學檢測。對於淋巴增生性疾病的病理診斷我們用的最多的病原檢測就是EB病毒感染的檢測，而採用的方法可以是EB病毒的EBER，即EB病毒編碼小分子RNA的原位雜交，也可以是採用EB病毒的蛋白LMP1的檢測。但是從準確性來講，或者說作為金標準來講，EBER原位雜交應該是一個首選，其次就是對於幽門螺桿菌的觀察。我們在普通HE染色切片上就可以進行觀察，也可以採用特殊染色，比如WS或者是姬母薩染色，還有免疫組化染色也可以進行。其它的就是HBV、HCV的觀察，我們可以通過免疫組化來進行。

再談一下院際會診的病理診斷，因為對於淋巴增生性疾病，它本身是有相當難度的，對於基層醫院可能又不具備一些比較重要的輔助檢查條件，比如即便有免疫組織化學染色，但是涉及到淋巴瘤診斷的這樣一些抗體組合可能不是那麼全。在這種情況下，院際會診是解決淋巴增生性疾病的一些疑難病例的病理診斷的一個非常有效的途徑，所以我們也是很強烈地推薦在不具備條件或者不完全具備條件的這樣一些機構或者是醫院，對於這些疑難的淋巴組織增生性疾病，盡量地去選擇會診。選擇會診的時候我們需要注意哪些問題、即需要提供哪些會診相關的材料呢？主要有這麼幾個方面：一是HE切片，但如果提供了蠟塊的話，可以不提供切片，接受會診的單位可以自制切片。二就是各種輔助檢查的結果，包括前面的免疫組化、原位雜交等等。會診的病例材料就是蠟塊或者是足量的白片。我們還是推薦使用蠟塊。三是相應的文書記錄，比如原始的病理診斷的情況，或者是相關的複印件。盡量提供一些臨床的資料，我們知道這些臨床資料對淋巴增生性疾病的病理診斷和分析也是非常重要的，包括詳細的病史、出院小結、病情簡介等等，還有一些實驗室檢查結果。對於皮膚病變最好有病變的照片。對於院際會診我們需要提供這樣的一些材料。這樣的原始切片和借用的蠟塊，在會診結束以後都會歸還給送會診的單位，所以這個大家不必擔心。會診意見也是供各個會診單位、包括患者或者家屬參考。

最後我們就來看看病理報告的內容和格式問題。我們前面講了淋巴組織腫瘤的病理診斷是一個四結合的原則：病理形態學、免疫表型、遺傳學以及臨床表現的一個綜合分析，那麼病理報告的內容上就有兩個方面：一是共性的內容，即和所有的病理診斷報告的內容是類似的，比如患者的基本信息。二是個性方面的內容，就是跟淋巴組織腫瘤或者淋巴組織疾病相關的一些信息，因為淋巴組織疾病的病理診斷和其它的有些不同，就是很多的輔助檢查結果都是為它的病理診斷和組織分型服務的，所以這樣的結果都是需要整合到病理診斷報告裡面去的。其它需要整合到報告裡面的信息還可以有診斷醫生的評論，比如一些很少見的疾病或者可能臨床醫生不是那麼熟悉的，我們會有一些comment，甚至還可能會提供一些主要的或者是重要的參考文獻和書籍，這些都可以作為報告的一部分。

最後舉個例子。這是一個43歲的女性病人，是頸部包塊的切除活檢。組織學我們看到的這個淋巴結，結構是完全看不到了，看到的是一些中等偏大的異型淋巴樣細胞的瀰漫性增生和浸潤。高倍下我們看到這樣的一些細胞，形態基本上是一些中心母細胞樣的細胞，細胞的一致性比較好，而且看到有比較多的核分裂以及部分細胞凋亡的情況。免疫表型檢測，我們選擇細胞屬性相關的抗原CD20，這些細胞是陽性的，而背景的小淋巴細胞是CD3ε陽性的。漢斯分型相關的3個標記bcl-6和MUM-1陽性提示是一個活化B細胞來源的腫瘤。Ki-67指數比較高，80%。其他預後相關的標記我們做的有CD5，腫瘤細胞有一些弱的陽性反應，而強的反應是反應性T細胞成分。NF-kb胞漿的陽性是不能判斷為陽性的，必須要是核的陽性才有意義。另外兩個很重要的就是bcl-2和myc蛋白的表達情況，bcl-2超過了50%，myc超過了40%，所以這個又提示是一個c-myc和bcl-2和雙表達的腫瘤。Tp53蛋白的表達是陽性的，其它的我們也做了cyclinD1，這是一個陰性的，它的內對照組織細胞和血管內皮細胞是陽性的，EBER是陰性。最後結合形態學、免疫組織化學化學染色的結果和一般原則等等，我們綜合出了這個病理診斷，包括了這個腫瘤的組織學類型、免疫學亞型和一些要建議的工作。所以病理報告的格式我們還是推薦這種條目式的或者是框架式的報告，很清楚，臨床醫生也很容易捕捉到他所關心的一些信息。這樣的報告包括了病變的部位、樣本的類型、必要的時候可以做組織學的描述、病理診斷和組織學分型。這些輔助檢查的結果都整合在裡面了。免疫組織化學染色提示是非生髮中心B細胞來源的腫瘤。然後，這是預後相關的一些標記的表達的情況和它的結果分析：它是一個bcl-2和myc蛋白雙表達的腫瘤。這樣的一個腫瘤，高增殖活性，有myc和bcl-2的雙表達，所以我們要建議他做FISH，做基因分析，下面就是一個建議，建議做熒光原位雜交檢測，以除外特殊類型，主要是高級別的大B細胞淋巴瘤伴myc或bcl-2/bcl6易位，這樣的腫瘤它對一般的大B細胞淋巴瘤治療效果是不好的，這是必須給臨床提供的一些信息。

最後我們做一個總結：

l對於淋巴增生性疾病的病理診斷，（第一個方面）一張好的HE切片是非常重要的，而一張好的HE切片的得來離不開標本的及時切取固定和整個的病理技術過程。對於淋巴增生性疾病的病理切片，因為它的細胞比較豐富，我們再次強調切片宜薄不宜厚。

l第二個方面就是在我們的實際工作中，我們都知道了淋巴增生性疾病病理診斷的四結合的原則，但是怎麼樣能夠更好地使用好這個四結合的原則是更為關鍵的。

l第三個方面的就是免疫組化染色的抗體選擇我們要把握的基本原則。首先它是基於形態學；二要考慮到病理診斷和鑒別診斷方面的一些內容，同時要兼顧衛生經濟學方面問題，也就是說要給病人省錢。

l最後就是對於一些疑難的淋巴組織增生性疾病的病理診斷，院際會診是一個非常有效的途徑。

今天我們這個培訓就到這裡，謝謝大家。